姜佳玉 王汐文 唐希遠(yuǎn) 陳麗華.*

(1 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，長(zhǎng)沙 410013；2 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院麻醉系，長(zhǎng)沙 410013)

白念珠菌(Canidia albicans)是一種條件致病性真菌，存在于正常人口腔、上呼吸道、陰道及皮膚黏膜表面，于正常人群無(wú)害，易導(dǎo)致癌癥、艾滋病和器官移植等免疫功能嚴(yán)重低下的患者發(fā)生口腔念珠菌病、念珠菌性陰道炎等真菌感染。近年來(lái)，由于抗菌藥物的廣泛使用，免疫性疾病的逐漸增加，器官移植的發(fā)展，各種植入性醫(yī)學(xué)材料的使用以及醫(yī)務(wù)人員對(duì)真菌感染診斷技術(shù)的提高，臨床上的真菌感染愈發(fā)增多[1]。全球每年約有4000萬(wàn)例念珠菌感染患者，其中白念珠菌是最主要的病原體約占總病例的50%～70%[2-4]，給人類健康帶來(lái)極大威脅。形成生物被膜的白念珠菌對(duì)抗菌藥物和生物殺傷劑的耐受性更是顯著提高，對(duì)常用的唑類藥物如氟康唑、伊曲康唑、酮康唑等的耐藥性顯著增加[5]。而且，生物被膜狀態(tài)下的白念珠菌能逃避宿主的免疫攻擊[6]。這些特性使得感染持續(xù)存在，這對(duì)于白念珠菌的治療是一個(gè)極大的挑戰(zhàn)。因此，探索白念珠菌生物被膜治療方法對(duì)臨床白念珠菌感染治療大有裨益。

1 白念珠菌生物被膜的形成

生物被膜又稱生物膜(biofilm)，是指微生物黏附在組織表面時(shí)，由自身產(chǎn)生的大量胞外基質(zhì)包裹有特定功能和結(jié)構(gòu)的菌細(xì)胞所形成的結(jié)構(gòu)。生成生物膜是菌細(xì)胞在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中為適應(yīng)環(huán)境變化而形成的一種生存方式[7]。典型的白念珠菌生物被膜結(jié)構(gòu)大致由3部分組成，即物體表面的數(shù)層酵母相細(xì)胞黏附形成基底部，內(nèi)部的菌絲形成中間層，最外層由大量胞外基質(zhì)覆蓋[8]。

白念珠菌生物被膜的形成過程可分為以下4步：首先，白念珠菌通過可逆的疏水作用和靜電力來(lái)進(jìn)行黏附，其分泌孢子黏附在物體表面，對(duì)非生物表面的黏附主要由疏水相互作用介導(dǎo)，而對(duì)生物表面的黏附則由黏附素如凝集素控制；其次是微菌落的形成，細(xì)胞自身分泌的胞外聚合物具有黏結(jié)錨定作用，可使單個(gè)真菌細(xì)胞形成真菌團(tuán)，多個(gè)真菌團(tuán)塊形成肉眼可見的菌落；然后是以聚合物的產(chǎn)生和分泌為特征的時(shí)期，分泌的胞外基質(zhì)逐漸增多，形成由孢子、菌絲體和假菌絲組成的高度結(jié)構(gòu)化的三維網(wǎng)狀系統(tǒng)；最后，白念珠菌可以從物體表面分離(作為單細(xì)胞或聚集體)，成為浮游生物，并在新的表面定居進(jìn)而形成新的生物膜[9](生物膜的擴(kuò)散)。生物被膜狀態(tài)的白念珠菌在各種表型如形態(tài)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、致病性、毒力大小、藥物敏感性等及基因型上均與浮游狀態(tài)菌有顯著差異[10]，故其治療難度也更高，所以需要探究不同的治療方法。

2 白念珠菌生物被膜的治療

2.1 藥物治療

2.1.1 抗真菌藥物

多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，由于白念珠菌生物被膜形成后產(chǎn)生耐藥性，大多數(shù)目前使用的抗真菌藥物對(duì)白念珠菌形成的生物膜的治療效果都不明顯。因此，需要開發(fā)治療耐藥生物膜的新策略?？拱啄钪榫锉荒さ男滦涂咕幬铩獌尚悦顾谺脂質(zhì)體具有脂溶性，穩(wěn)定性強(qiáng)，能穿透白念珠菌等真菌形成的生物被膜，與真菌細(xì)胞膜上的麥角固醇結(jié)合，改變細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)容物流出，細(xì)胞死亡，表現(xiàn)出良好的治療效果[11]。臨床研究表明，兩性霉素B脂質(zhì)體治療白念珠菌感染的總有效率為77.78%[12]。另有棘白菌素類藥物逐漸被應(yīng)用于白念珠菌生物被膜狀態(tài)的感染，主要有卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈，此類藥物能夠阻礙白念珠菌與上皮細(xì)胞之間的黏附，抑制白念珠菌生物和非生物的黏附，阻止芽管的形成[13]，并從而抑制生物被膜的形成，是一類極具前景的新型抗真菌藥。

2.1.2 中藥有效成分

我國(guó)在天然植物及其提取物的藥用方向上具有悠久的歷史，且在不斷的發(fā)展和探索中藥在感染性疾病方面的應(yīng)用，目前中藥已經(jīng)成為抗真菌藥物開發(fā)的新方向。殼聚糖(chitosan)又稱脫乙酰甲殼素，是由蝦蟹等殼類生物的殼經(jīng)過脫乙酰作用得到的聚合物，其可以抑制白念珠菌生物被膜的形成并且通過對(duì)抗生素的修飾增強(qiáng)對(duì)生物被膜的破壞效果[14]。復(fù)方百膚青已經(jīng)成為治療陰道念珠菌病的輔助藥物，研究顯示250g/L的百膚青能明顯破壞白念珠菌的生物被膜，達(dá)到治療的效果[15]。中藥穿心蓮中的穿心蓮內(nèi)酯可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)白念珠菌生物膜的凋亡，促進(jìn)ROS生成誘導(dǎo)凋亡，并且可以促進(jìn)生物膜的分散[16]。赤芍的主要成分芍藥苷[17]和厚樸冷浸液[18]均可以破壞生物膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，抑制牙管和菌絲的形成，抑制白念珠菌的黏附繼而抑制生物膜的形成。

2.1.3 益生菌

益生菌(probiotics)，指可維持宿主腸道微生物均衡并對(duì)宿主有益的活性微生物，如乳酸菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、酵母菌等，其對(duì)人體健康有極大的保護(hù)作用，在預(yù)防生殖系統(tǒng)感染、增強(qiáng)人體免疫力、幫助消化吸收、增強(qiáng)新陳代謝等方面已有廣泛的應(yīng)用。益生菌已成為近年來(lái)抑制生物被膜治療的研究熱點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)益生菌可以抑制生物被膜的形成，其中乳酸桿菌應(yīng)用得到了極大認(rèn)可。Krzysciak等[19]報(bào)道唾液乳桿菌可以抑制致齲齒的變異鏈球菌和白念珠菌混合菌的生物被膜的形成，通過抑制白念珠菌形成假菌絲和牙管來(lái)降低白念珠菌的致病性。Wasfi等[20]報(bào)道干酪乳桿菌、羅氏乳桿菌、植物乳桿菌和唾液乳桿菌通過降低胞外多糖，酸耐受和群體感應(yīng)相關(guān)的基因抑制致齲齒的變異鏈球菌的生物膜形成。Rossoni等[21]檢測(cè)了30株分離自無(wú)齲齒人群的乳酸桿菌對(duì)白念珠菌生物被膜形成的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其可通過下調(diào)ALS3、HWP1、CPH1和EFG1基因的表達(dá)來(lái)抑制生物被膜的形成。臨床上已有用抗菌藥物聯(lián)合乳酸桿菌治療念珠菌感染的病例報(bào)告。有報(bào)告顯示，臨床上分別使用益康唑[22]和甲硝唑[23]聯(lián)合乳酸菌陰道膠囊治療念珠菌陰道炎時(shí)，發(fā)現(xiàn)加用乳酸菌輔助后治療總有效率提高了，復(fù)發(fā)率降低了。這顯示了乳酸桿菌在白念珠菌治療中的作用已被承認(rèn)，未來(lái)將有更大的研究空間。

2.1.4 新型抗菌膜劑

目前，研究人員已經(jīng)開發(fā)出大量具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的潛在抗菌膜劑，它可以促進(jìn)預(yù)先形成的生物膜的分散或者抑制體內(nèi)新生物膜的形成，在分散現(xiàn)有生物膜或防止細(xì)菌在體外形成生物膜方面顯示出巨大的前景。Bendaoud等[24]研究出一種可以抑制其自身生物膜形成的多糖,調(diào)控生物膜結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)細(xì)胞在擴(kuò)散階段的釋放，抑制如金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌和白念珠菌的生物膜形成。既能使已形成的生物膜的分散又能殺死生物膜細(xì)菌的抗菌膜劑還可以與有效的抗微生物藥物組合以增強(qiáng)其活性來(lái)治療生物被膜。另有研究發(fā)現(xiàn)，(1)-N-2-甲氧基芐基-1,10-菲咯啉溴化物或可作為抗白念珠菌的新型抗菌膜劑。其作為螯合劑破壞生物膜中細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，抑制蛋白酶的功能，干擾了多種生物系統(tǒng)的功能，發(fā)揮出抗菌作用。在實(shí)驗(yàn)中用掃瞄電子顯微鏡(SEM)圖像證實(shí)了其能導(dǎo)致白念珠菌生物膜基質(zhì)破壞[25]。

2.1.5 作用于生物被膜基質(zhì)的藥物

生物被膜豐富的胞外基質(zhì)具有保護(hù)其內(nèi)部的真菌，避免抗菌藥物破壞真菌細(xì)胞的作用，故在治療時(shí)常表現(xiàn)出一定的耐藥性。生物膜細(xì)胞的耐藥性增加已經(jīng)被解釋為抗菌劑通過生物膜基質(zhì)的延遲滲透?？咕鷦┍仨毻ㄟ^水通道擴(kuò)散通過細(xì)胞外基質(zhì)才能到達(dá)細(xì)胞。當(dāng)目標(biāo)細(xì)胞位于生物膜中時(shí)，基質(zhì)可以作為抗微生物化合物的屏障。此外，基質(zhì)成分也可以直接結(jié)合抗微生物劑導(dǎo)致耐藥。因此可以開發(fā)作用于被膜基質(zhì)的藥物，加速生物被膜的裂解，減弱被膜的阻隔作用；或者通過改變被膜基質(zhì)的通透性或厚度加速藥物的滲透，使進(jìn)入被膜內(nèi)的藥物達(dá)到抑菌濃度，使藥物發(fā)揮應(yīng)有的作用。理論上治療白念珠菌被膜感染的關(guān)鍵在于破壞被膜后直接殺菌。有研究人員決定運(yùn)用酶消化生物被膜基質(zhì)的方法來(lái)觀察被膜基質(zhì)的保護(hù)作用，由于胞外基質(zhì)中含有DNA且與生物被膜結(jié)構(gòu)的維持和保護(hù)其三維立體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)，故實(shí)驗(yàn)中比較用傳統(tǒng)抗生素治療及加用DNA酶聯(lián)合治療的效果，發(fā)現(xiàn)由于DNA酶破壞了被膜基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，抗菌的效果非常顯著[26]。另有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌自身可以產(chǎn)生一種降解生物被膜多糖的水解酶。實(shí)驗(yàn)中將該糖苷水解酶加入到已形成生物被膜的菌落，可以直接破壞生物被膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使其裂解消亡[27]。對(duì)真菌生物被膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)，形成方式，形成特點(diǎn)的研究有助于找到突破其基質(zhì)的方法，發(fā)現(xiàn)治療生物被膜的新方法。

2.2 生物醫(yī)學(xué)材料的改良

生物被膜常常形成于植入的醫(yī)學(xué)生物材料表面。它會(huì)導(dǎo)致植入失敗，造成大量的經(jīng)濟(jì)損失，給患者身體帶來(lái)極大負(fù)擔(dān)，造成很多不良后果。大多數(shù)真菌細(xì)胞都能夠黏附與定殖于常用生物醫(yī)學(xué)材料表面，從而形成生物被膜繼而產(chǎn)生耐藥性。如果可以對(duì)現(xiàn)有的植入材料進(jìn)行改進(jìn)，阻止病原菌的附著，即可以避免生物被膜的形成。生物醫(yī)學(xué)材料改良的主要策略是表面覆蓋涂層隔絕真菌和材料表面的接觸或者是緩慢釋放抗菌藥物持續(xù)阻止被膜的形成。超高分子量聚乙烯(UHMWPE)用低壓氮等離子體處理可以提高抗生物污損性。用該材料進(jìn)行大腸埃希菌生物膜形成的研究，并使用光學(xué)顯微鏡和原子力顯微鏡(AFM)對(duì)其成像。與未處理的聚合物相比，等離子體處理顯著減少了表面上的細(xì)菌附著。這可歸因于表面疏水性降低阻止了細(xì)菌與表面的相互作用[28]。研究證明納米銀粒子具有廣譜快速?gòu)?qiáng)效的殺菌作用且無(wú)耐藥性，具有抵抗真菌生物被膜的活性，可以抑制植入導(dǎo)管上生物被膜的形成，目前已投入臨床使用[29]。研究人員將鍍銀縫合袖套植入了一只人工感染的豚鼠體內(nèi)，其產(chǎn)生的炎癥比未涂覆的織物少[30]。這些研究成果揭示了可以對(duì)生物醫(yī)學(xué)材料進(jìn)行改進(jìn)和完善，以達(dá)到防止植入材料上的白念珠菌生物被膜感染的目的。

2.3 其他療法

光動(dòng)力治療(photodynamic therapy,PDT)是目前常用于治療尖銳濕疣，眼底病變和腫瘤等疾病的方法。由于其操作安全簡(jiǎn)單、非特異、不易產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，具有治療耐藥菌株的作用，所以也逐漸用于抗菌治療中。有研究以白念珠菌生物膜為模型，在不同波長(zhǎng)的紅光下，照射不同時(shí)間，探究光敏劑對(duì)生物膜的殺傷作用，用菌落計(jì)數(shù)法比較殺菌率。發(fā)現(xiàn)光敏劑TBO在633nm紅光下對(duì)白念珠菌生物膜具有顯著殺傷效果[31]。另有研究是用激光共聚焦掃描顯微鏡探究在5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法(ALA-PDT)過程中不同光照劑量對(duì)白念珠菌生物被膜活性的抑制作用，定量分析ALA-PDT對(duì)白念生物膜的殺傷作用。最終發(fā)現(xiàn)ALA-PDT能夠?qū)ι锬?nèi)的細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用并且可以直接作用于生物膜[32]。目前光動(dòng)力療法在抗白念珠菌生物被膜方面已有一定的研究成果，并且已經(jīng)應(yīng)用于臨床具有重要的臨床意義，相信它會(huì)在抗被膜方向成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

臨床治療生物被膜形成狀態(tài)的白念珠菌感染非常困難，給患者的身心健康帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)，因此亟需尋求一個(gè)合適有效的方法。目前在抗真菌藥物領(lǐng)域兩性霉素β-脂質(zhì)體和棘白菌素類藥物均廣泛應(yīng)用，中藥運(yùn)用方面，肉桂、赤芍、穿心蓮等藥物有一定的輔助作用，生物被膜結(jié)構(gòu)和形成方面及生物醫(yī)學(xué)材料的改良等領(lǐng)域也均有一定的研究成果，但在治療生物被膜狀態(tài)的白念珠菌感染時(shí)常遇到耐藥的瓶頸，研究人員對(duì)生物被膜形成機(jī)制的研究和抗被膜藥物的開發(fā)將有助于解決其治療過程中的耐藥問題，促進(jìn)患者的康復(fù)，保護(hù)人類的健康。