黨媛

摘要：雞彎曲桿菌性肝炎又稱雞弧菌性肝炎，是由空腸彎曲桿菌（又稱弧菌）侵害雞的肝臟、脾臟、腎臟等內(nèi)臟器官而引起的一種細(xì)菌性傳染病。本研究對(duì)采集疑似患彎曲桿菌性肝炎的病雞肝臟進(jìn)行空腸彎曲桿菌分離鑒定，并分析了該分離菌株抗生素敏感性，為有效控制此次空腸彎曲桿菌污染提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：蛋雞;空腸彎曲桿菌;分離;鑒定

中圖分類號(hào)：S858.31??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：2095-9737（2019）11-0021-02

不同日齡的雞群都可感染空腸彎曲桿菌，但開產(chǎn)前后更易感染發(fā)病，雛雞感染后死亡率高，成年雞死亡率較低，但耐過雞生產(chǎn)力降低。病雞多出現(xiàn)肝臟腫大充血、壞死、變性等病理變化。病雞和帶菌雞是該病的主要傳染源，健康雞主要通過消化道感染。通常雞彎曲桿菌性肝炎多呈散發(fā)性流行，飼養(yǎng)管理不當(dāng)或治療不及時(shí)常繼發(fā)感染其他疾病，導(dǎo)致發(fā)病率、死亡率升高，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)空腸彎曲桿菌被認(rèn)為是引起人類腹瀉的常見病原菌之一，而其主要來源是禽肉產(chǎn)品，因此作為日益嚴(yán)峻的食源性疾病也威脅著公共衛(wèi)生安全。

1 發(fā)病情況

2018年7月，青海省西寧市某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生疑似雞彎曲桿菌性肝炎的疫情，最初在產(chǎn)蛋初期軟殼蛋、砂殼蛋產(chǎn)出較多，但產(chǎn)蛋率可保持正常水平，到了產(chǎn)蛋中期產(chǎn)蛋率顯著下降，發(fā)病率也有顯著增加，大部分發(fā)病雞食欲下降、精神不振、雙眼無神、腹瀉、排黃白色水樣稀便，并伴隨零星雞死亡的情況，病死雞多雞冠蒼白、腹部增大。

2 臨床剖檢

隨機(jī)取20只病死雞進(jìn)行病理剖檢，發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)有大量紅色腹水，肝臟腫大質(zhì)脆、邊緣鈍圓、表面有黃白色壞死灶，脾和腎蒼白腫大、有針尖大小的出血點(diǎn)，心肌蒼白、心冠有出血斑點(diǎn)，有的病雞小腸黏膜有充血、出血，盲腸淋巴充血，有的病死雞卵巢變性、卵泡破裂。無菌條件下采集病死雞的肝臟組織進(jìn)行病原菌分離。

3 分離培養(yǎng)

將肝臟病料接種于改良CCDA選擇性培養(yǎng)基上，置于10%濃度CO2恒溫箱中42℃培養(yǎng) 36 h，在培養(yǎng)基表面出現(xiàn)邊緣整齊、圓形、有金屬光澤的小菌落。將分離菌和病死雞肝臟經(jīng)革蘭氏染色后，鏡檢均可見革蘭氏陰性彎桿菌，呈逗點(diǎn)狀、螺旋狀或S狀。

4 PCR鑒定

采用雙重PCR對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，引物分別參照彎曲桿菌屬16S rRNA和空腸彎曲桿菌mapA基因序列設(shè)計(jì)，P1：5'-ATCTAATGGCTTAACCATTAAAC-3'，P2：5'-GGACGGTAACTAGTTTAGTATT-3'，目的條帶為857bp;F1：5'-CTATTTTATTTTTGAGTGCTTGTG-3'，F(xiàn)2：5'-GCTTTATTTGCCATTTGTTTTATTA-3'，目的條帶為590 bp。

用挑取CCDA平板上的典型可疑菌落加入200 μL超純水中混勻，沸水煮沸10 min，取出立即置于冰上，10000 r/min離心5 min，取上清做PCR鑒定的模板。

PCR反應(yīng)體系為：2×Taq PCR Master Mix 10 μL、兩對(duì)上下游引物各0.5 μL、模板1 μL，補(bǔ)滅菌水至20 μL，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠板電泳后，用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析，結(jié)果與預(yù)期相符。根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀、病理變化、實(shí)驗(yàn)室檢查等，最終確定該蛋雞場(chǎng)感染了空腸彎曲桿菌。

5 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)該蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)日常的用藥情況，選擇常用的氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、紅霉素、阿奇霉素、克林霉素、林可霉素、氟苯尼考、磷霉素、多黏菌素B、多西環(huán)素共計(jì)17種抗生素進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作及判定。將菌液稀釋到一定濃度均勻涂布到CCDA平板上，將選定的藥敏片貼到平皿上合適的位置后，42℃微需氧培養(yǎng)48 h，根據(jù)各藥敏片的抑菌圈直徑判定藥物的敏感性，結(jié)果分離菌對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松、環(huán)丙沙星敏感，對(duì)氟苯尼考、磷霉素中敏，對(duì)多西環(huán)素低敏，其余均耐藥。

6 毒力測(cè)定

將典型菌落純化后的菌液接種到10枚8日齡雞胚卵黃囊內(nèi)，0.2 mL/枚，置于37℃溫室內(nèi)繼續(xù)孵化。結(jié)果第三天死亡4枚，第四天死亡5枚，第五天死亡1枚，死胚均出現(xiàn)胚體出血、肝臟壞死癥狀。收集死胚的尿囊液，經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢，發(fā)現(xiàn)有呈螺旋狀、S型的陰性菌;將采集的病雞肝臟、脾臟等組織進(jìn)行研磨后和收集的尿囊液混合，用適量的滅菌生理鹽水制成懸液，通過口服的方式接種6只18周齡健康蛋雞，結(jié)果在48 h內(nèi)均發(fā)病，且臨床癥狀、病理剖檢和革蘭氏染色等結(jié)果同養(yǎng)殖場(chǎng)病雞相同。

7 結(jié)論

本研究從疑似感染空腸彎曲桿菌的蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)采取病料，通過剖檢、細(xì)菌分離鑒定等相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，最終確診了該養(yǎng)雞場(chǎng)疫情為雞彎曲桿菌性肝炎，并結(jié)合藥敏試驗(yàn)，對(duì)臨床用藥給予了科學(xué)的指導(dǎo)，選擇高敏抗菌藥物進(jìn)行治療后，疫情得到了有效的控制。

目前空腸彎曲桿菌是最為常見的一種食源性致病菌，在家畜家禽等動(dòng)物體內(nèi)普遍存在。研究發(fā)現(xiàn)雞是最易攜帶空腸彎曲桿菌的動(dòng)物，開產(chǎn)前后的蛋雞最容易發(fā)病，多呈散發(fā)或地方性流行。

我國(guó)作為禽類的養(yǎng)殖大國(guó)，禽類產(chǎn)品在消費(fèi)品市場(chǎng)占有很大的比例，人類感染空腸彎曲桿菌的主要途徑就是食用了污染的禽類產(chǎn)品，一旦感染將導(dǎo)致腹瀉、關(guān)節(jié)炎和格林-巴利綜合征等疾病，嚴(yán)重危害公共安全，因此應(yīng)加強(qiáng)從養(yǎng)殖場(chǎng)到百姓餐桌的空腸彎曲桿菌的監(jiān)測(cè)工作。

臨床上雞彎曲桿菌性肝炎常與其他疾病如大腸桿菌病、支原體病、沙門氏菌病等發(fā)生混合感染，致使發(fā)病雞群的病死率顯著提高，嚴(yán)重?fù)p害養(yǎng)雞業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，綜上所述在養(yǎng)殖過程中有效防控空腸彎曲桿菌具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。