劉 偉 黃 健 陳彩霞 王 丹

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)大學(xué)第二附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)并以關(guān)節(jié)滑膜炎癥及關(guān)節(jié)病變進行性發(fā)展為主要特征的慢性免疫系統(tǒng)疾病。高遷移率族蛋白1（high mobility group box chromosomal protein 1，HMGB1）是一種高度保守的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，在相關(guān)因子刺激下可釋放至細(xì)胞核外及細(xì)胞外參與炎性反應(yīng)并表達一定生物學(xué)特性，其在RA等多種炎癥性自身免疫性疾病中均發(fā)揮重要的作用[1]。目前，HMGB1已成為RA 發(fā)病機制研究的新熱點，本文就RA 及HMGB1的基本特征及兩者的相互作用機制進行淺析。

1 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）

RA 是一種以全身性多關(guān)節(jié)受累、關(guān)節(jié)滑膜炎癥進行性發(fā)展以及骨和軟骨組織不可逆性破壞為主要特征的慢性非特異性炎性疾病[2]，病變呈全身性及對稱性。RA 在年齡30～60歲的女性中發(fā)病較為常見[3]。近年來其發(fā)病率逐漸升高，世界范圍內(nèi)成人的發(fā)病率為0.5%～1%[4]。RA 作為系統(tǒng)性疾病其發(fā)病與自身免疫、遺傳及外界環(huán)境等多種因素有關(guān)[5-8]，但迄今尚無定論，其基本病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥[9-10]。

2 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞/類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（RASFs）

正常關(guān)節(jié)滑膜由1～2層滑膜細(xì)胞構(gòu)成，即滑膜成纖維細(xì)胞（成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞）和滑膜巨噬細(xì)胞（巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞）[11]。

以往研究考慮滑膜成纖維細(xì)胞是一種未涉及關(guān)節(jié)病變的生理性細(xì)胞，分泌關(guān)節(jié)滑液營養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨并在關(guān)節(jié)活動過程中起潤滑作用，分泌及微量炎性細(xì)胞因子主要起維持滑膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用[11]。近來，相關(guān)研究報道并證實在RA 病損關(guān)節(jié)滑膜組織的病理研究中，滑膜及滑膜細(xì)胞并非呈生理性表現(xiàn)，體現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜明顯增厚，RASFs 大量增生[12]。另有相關(guān)研究表明RASFs 參與合成并釋放參與炎性反應(yīng)的炎性細(xì)胞因子以及參與骨與軟骨基質(zhì)降解的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）作用于關(guān)節(jié)腔，從而引起關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞[12-13]。故而RASFs 的大量形成是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[14-18]。然而，該病理過程的確切發(fā)生機制尚未可知，有待進一步實驗論證。

3 高遷移率族蛋白1（HMGB1）

HMGB1最初由Johns 于20世紀(jì)60年代初期發(fā)現(xiàn)，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中（Western blot 中的SDS-PAGE）遷移率高而得名，是一種在大多數(shù)真核細(xì)胞中廣泛表達、且高度保守的非組蛋白核蛋白[19]。HMGB1一級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包括215個氨基酸殘基，其超二級結(jié)構(gòu)包括A box 和B box 兩個結(jié)構(gòu)域，每一個結(jié)構(gòu)域由與另一結(jié)構(gòu)域29%同源且65%相似的80個氨基酸殘基構(gòu)成，可提供相應(yīng)功能DNA 次級結(jié)構(gòu)結(jié)合位點[19]。HMGB1 B box 為促炎因子作用結(jié)構(gòu)域，重組的B box 可激活單核巨噬細(xì)胞并促使其釋放腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、γ 干擾素（interferon-γ，INF-γ）、白細(xì)胞介素1β（interleukin1β，IL-1β）、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）及血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）等多種炎癥介質(zhì)[20]。A box是一個抗炎因子結(jié)構(gòu)域，競爭性抑制B box 及全長HMGB1的活性[21-22]。脈沖追蹤研究揭示，HMGB1存在于細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外[1]。存在于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核中的HMGB1其DNA 次級結(jié)構(gòu)結(jié)合域可與DNA 相關(guān)位點結(jié)合，調(diào)節(jié)DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)象，進而參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、核小體的穩(wěn)定及細(xì)胞運動等[23]。存在于細(xì)胞外的HMGB1本身不具備炎癥活性[24-25]，但其可與內(nèi)、外源性促炎因子結(jié)合形成復(fù)合物，以協(xié)同刺激的方式在炎性反應(yīng)中起重要作用[26-27]。研究表明，外源性促炎因子包括酯多糖（lipopolysaccharide，LPS）、細(xì)菌DNA、細(xì)菌RNA等，其中LPS 具有代表性。內(nèi)源性促炎因子包括細(xì)胞因子IL-1β、趨化因子CXCL12及核小體等，其中IL-1β 具有代表性[26,28-29]。

HMGB1-partner 分子（內(nèi)、外源性促炎因子）復(fù)合物可與Toll 樣受體2（toll-like receptor，TLR2）、Toll樣受體4（toll-like receptor4，TLR4）、晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）及趨化因子CXC 受體4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）等多種細(xì)胞表面受體結(jié)合，刺激單核巨噬細(xì)胞激活NF-κB 通路引起炎癥效應(yīng)[30]。研究證實有50%～60%的HMGB1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)與RAGE 的相互作用有關(guān)，但目前RAGE 具體機制尚未闡明，有待后續(xù)研究論證[31]。而HMGB1所引起的炎癥效應(yīng)中合成并釋放的TNF、INF-γ 及IL-1β等細(xì)胞因子又可反作用于單核巨噬細(xì)胞使其釋放HMGB1[32]，促進炎癥效應(yīng)。

動物實驗證明，HMGB1基因敲除的細(xì)胞發(fā)生壞死時其炎性反應(yīng)明顯減弱[33]。另有研究表明，人及鼠單核巨噬細(xì)胞中加入純化的重組HMGB1，產(chǎn)生炎癥效應(yīng)共同培養(yǎng)時間較內(nèi)毒素刺激明顯推后[1]。

基于在不同模式的炎癥環(huán)境中以HMGB1為靶點的炎癥效應(yīng)表達，可以推斷胞外的HMGB1是一種潛在的中晚期炎癥誘導(dǎo)因素[27,34-35]。

4 HMGB1與RA 相關(guān)性

4.1 RA 患者血清中HMGB1表達

目前，對于RA 患者血清中HMGB1的表達，國內(nèi)外研究尚存爭議。相關(guān)研究對納入67例活動期RA患者及21名健康對照人員進行檢測，活動期RA 患者血清HMGB1表達明顯高于健康對照人員，差異具有顯著性[36]。另一項研究納入105例樣本，結(jié)果顯示RA 患者血清HMGB1表達高于活動期組，活動期組RA患者血清HMGB1表達高于緩解期組，三組組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義[37]，這一結(jié)果與國內(nèi)多數(shù)研究報道一致[38-44]。但早期報道對納入30例RA 患者的樣本進行研究，其血清HMGB1水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其可能與樣本含量及檢測手段有關(guān)[45]。

部分研究考慮血清HMGB1來源于細(xì)胞核內(nèi)，由溶血磷脂酰膽堿誘導(dǎo)溶酶體胞吐作用的非典型囊泡運輸途徑出胞[46]。另有研究認(rèn)為其可能來源于外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）[47]或滑膜巨噬細(xì)胞的主動分泌及炎癥效應(yīng)中的壞死細(xì)胞[48]。然而其確切來源尚不明確，有待深入研究。

炎癥誘導(dǎo)因素HMGB1的血清表達可能與RA 全身性滑膜炎癥的病理過程具有相關(guān)性。

4.2 RA 患者血清中HMGB1表達與血液炎性因素相關(guān)受體表達的相關(guān)性

RA 患者血清HMGB1表達與血液炎性因素相關(guān)受體表達相關(guān)?；顒悠赗A 患者血清HMGB1表達與PBMC 表面TLR2及TLR4表達呈顯著正相關(guān)，其表達量均顯著高于非活動期RA 患者及健康對照組[41,44,47]。另有研究證實RA 患者血清HMGB1與RA 保護性因子基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloprotein-2，MMP2）及其組織抑制因子-2（tissue inhibitor of metallopro teinase-2，TIMP2）水平呈負(fù)相關(guān)[40]。

故而血清HMGB1表達與血清炎癥因素表達可能在加重RA 關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥的病理過程中起重要作用。

4.3 RA 患者血清中HMGB1表達與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

RA 患者血清HMGB1表達與反映RA 炎癥程度和病情活動指標(biāo)的相關(guān)性尚未明確。研究報道RA 患者血清中HMGB1表達水平與紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）[41-42]及類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）呈正相關(guān)[43]，與關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、腫脹數(shù)、關(guān)節(jié)X 線分期呈正相關(guān)[37,47]。但也有研究顯示，活動性RA 患者血漿HMGB1水平與疾病病程、RF、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)及關(guān)節(jié)X 線分期無關(guān)[42]。尚有研究考慮活動性RA 患者血清HMGB1表達水平與疼痛視覺模擬評分法（VAS）評分、疲乏VAS 評分、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)及ESR、CRP、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體無相關(guān)性[36]。樣本量不足可能是上述研究差異性來源，有待多中心研究確定其相關(guān)性。

血清HMGB1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)病變早期是否具有臨床診斷參考作用還有待進一步研究證實[43]。

4.4 RA 患者滑膜中HMGB1表達

動物實驗顯示正常健康小鼠HMGB1表達于滑膜細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，HMGB1的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積極少存在，而佐劑誘導(dǎo)RA 小鼠模型于RASFs細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外均有HMGB1的過量表達[21-22]。相關(guān)研究顯示正常健康人關(guān)節(jié)滑膜上皮細(xì)胞存在HMGB1的表達，其分布以細(xì)胞核為主，于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)中微量表達，為典型非組蛋白核蛋白表現(xiàn)。而RA 關(guān)節(jié)滑膜中HMGB1分布以滑膜巨嗜細(xì)胞為主，RASFs和血管內(nèi)皮細(xì)胞也有一定量表達，滑膜下炎癥細(xì)胞極少有HMGB1的表達，且RA 關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的HMGB1表達于細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核內(nèi)少量存在及表達[49]。

作為炎性反應(yīng)中重要因子的HMGB1，其滑膜表達異常在RA 組織炎癥和損傷的病理過程中起重要作用[45]。

4.5 RA 患者滑膜中HMGB1表達與滑膜炎性因子表達的相關(guān)性

研究顯示在RA 患者關(guān)節(jié)病變早期，尚未增生的滑膜組織包括滑膜細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞質(zhì)已有HMGB1的分布異常及表達異常，但在此階段滑膜組織中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)炎性因子的增加[49]。隨滑膜組織進一步增生，細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞質(zhì)中HMGB1表達持續(xù)增加，滑膜TNF、IL-1β、INF-γ 和IL-6等炎癥介質(zhì)表達量明顯上升，且相關(guān)數(shù)據(jù)表明HMGB1表達量與滑膜TNF、IL-1β、INF-γ 和IL-6等炎性因子表達量呈協(xié)同相關(guān)性[38,49]。HMGB1及相關(guān)炎性因子在增生的滑膜組織的表達可能是參與RA 關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥的重要原因之一。

研究證實，缺血、激活的補體或TNF、IL-1β等炎性細(xì)胞因子刺激均可致關(guān)節(jié)滑膜HMGB1大量表達[50]。而相關(guān)研究表明HMGB1可刺激滑膜細(xì)胞釋放TNF、IL-1β、INF-γ 和IL-6等炎性因子，并呈劑量依賴性。故可推測HMGB1與相關(guān)炎性因子具有相互促進釋放的作用，而這一作用又加重RA 關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥的遷延過程。

4.6 HMGB1與RASFs 體外培養(yǎng)后分泌炎性細(xì)胞因子及MMPs 的相關(guān)性

研究表明，體外HMGB1促進RASFS 分泌炎性細(xì)胞因子及MMPs。HMGB1與IL-1β 或LPS 協(xié)同刺激可顯著促進RASFS 分泌TNF、IL-1β、INF-γ、IL-6、IL-8及MMP-3、MMP-13[45,51-52]。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）雙抗夾心法觀察相關(guān)致炎細(xì)胞因子及MMP 的表達水平，RT-PCR 顯示HMGB1與LPS 檢測其mRNA 表達水平，結(jié)果均證實HMGB1刺激與RASFs 釋放炎性細(xì)胞因子、MMP 具有相關(guān)性[12]。

炎性細(xì)胞因子及MMPs 在RA 滑膜慢性炎癥中具有關(guān)鍵作用，其不僅可由免疫分泌，還可以由RASFs分泌[12,40]。正常狀態(tài)下只有少量滑膜成纖維細(xì)胞/成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞合成部分細(xì)胞因子，其可能對維持關(guān)節(jié)內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)和防御功能有一定積極作用[12]。而HMGB1刺激狀態(tài)下的炎性細(xì)胞因子及MMPs 顯著增多很可能是參與了RA 的病變過程[12,51]。

4.7 HMGB1與RASFs 體外培養(yǎng)后增殖凋亡及自噬的相關(guān)性

體外HMGB1促進RASFs 增殖及自噬并抑制其凋亡。流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）結(jié)果表明與空白對照組、HMGB1刺激組、LPS 刺激組比較，HMGB1-LPS 復(fù)合物刺激后RASFs 進入S/G2期明顯增多，CCK-8顯示細(xì)胞增殖加快[3,11-12,51-52]。免疫印跡（Western blotting，WB）檢測各種刺激物刺激RASFs細(xì)胞Beelinl 和LC3 Ⅱ的表達變化，透射電鏡觀察自噬小體及自噬溶酶體，并經(jīng)免疫熒光檢測自噬相關(guān)蛋白LC3和Atg5表達，結(jié)果顯示，與HMGB1-LPS 復(fù)合物刺激后比較RASFs 自噬明顯增強[3,11]。Annexin VFITC/PI 雙染后FCM 檢測磷脂酰絲氨酸外翻及WB法檢測Bax/Bcl-2相關(guān)蛋白表達，結(jié)果表明HMGB1-LPS復(fù)合物定量刺激之后，RASFs 凋亡明顯減弱[3,11-12]。

HMGB1刺激下RASFs 增殖、凋亡及自噬平衡異常與RA 起病密切相關(guān)，RASFs 在增殖水平增強的情況下，凋亡水平明顯降低，自噬水平顯著升高，進而RA 患者病變關(guān)節(jié)滑膜組織進行性、病理性增生，最終影響病人的正常關(guān)節(jié)功能和結(jié)構(gòu)[53-55]。最終RASFs 增殖、凋亡及自噬失衡促進了RASFs 的病變過程[56-61]。

最近研究發(fā)現(xiàn)抑制RASFs 自噬，則細(xì)胞凋亡增多，結(jié)果提示自噬與凋亡可能存在一定的相互拮抗作用。這一結(jié)論可為抑制RASFs 自噬促使其凋亡，進而控制或減緩RASFs 病理性增生提供理論依據(jù)，有待進一步相關(guān)研究。

4.8 HMGB1與RASFs 體外培養(yǎng)后細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的相關(guān)性

HMGB1-LPS 復(fù)合物刺激后，體外研究培養(yǎng)的骨性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞（osteoarthritis synovial fibroblasts，OASFs）出現(xiàn)向RASFs 轉(zhuǎn)變的特征。與陰性對照組OASFs 細(xì)胞相比，HMGB1刺激后OASFs 細(xì)胞表型接近于RASFs：進入S/G2期明顯增多，細(xì)胞增殖加快；Bcl-2表達上調(diào)、Bax 表達降低，細(xì)胞凋亡受到抑制；LC3Ⅱ表達增多，細(xì)胞自噬增加；相關(guān)受體TLR2、TLR4及RAGE 表達上調(diào)[11,37]，同時趨化因子CCL2、CXCL12及黏附分子ICAM、VCAM 表達上調(diào)；細(xì)胞炎癥相關(guān)性信號通路分子NF-κB、SAPK/JNK 和p38 MAPK 明顯激活[12,52]；促炎細(xì)胞因子（TNF、IL-1β、INF-γ 和IL-6等）及MMPs mRNA 水平和蛋白表達水平上調(diào)[11]。

HMGB1-LPS 復(fù)合物可能與SFs 上的TLR2、TLR4、RAGE 結(jié)合，激活下游NF-κB、SAPK／JNK 和p38 MAPK信號通路，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子、趨化因子CCL2、CXCL12、ICAM、VCAM 的分泌，產(chǎn)生MMPs等，進而使得SFs增殖加速、自噬凋亡失衡，這一病理過程促使OASFs向RASFs 轉(zhuǎn)化，表型轉(zhuǎn)變的RASFs 呈現(xiàn)RA 的臨床表現(xiàn)與病理過程。故可知HMGB1-LPS 復(fù)合物有重要的促RASFs 作用，這一作用與RA 疾病演變緊密相關(guān)。

5 討論

RA 是自身免疫系統(tǒng)的慢性炎癥性疾病，其最主要的特征是慢性滑膜炎癥引起關(guān)節(jié)軟骨和骨組織病變，影響關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)及功能。RA 患者滑膜組織的主要特征是RASFs 過度增生并異常表達炎性細(xì)胞因子。

HMGB1作為炎癥誘導(dǎo)的中晚期，炎癥介質(zhì)在RA血清及滑膜組織中均過度異常表達，說明其參與了疾病過程，在關(guān)節(jié)滑膜、關(guān)節(jié)軟骨與骨組織病變中起著重要作用，且其表達水平與RA 病理過程及病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

HMGB1參與刺激PBMC 表面TLR2及TLR4表達上調(diào)，及滑膜TNF、IL-1β、INF-γ 和IL-6等炎性因子釋放。大量研究表明，細(xì)胞外和胞內(nèi)的TLR 配體活化激活惰性分化因子88（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）依賴的MAPKs 通路，進而活化NF-κB，最終導(dǎo)致炎性細(xì)胞介質(zhì)產(chǎn)生并釋放，外周血TLR 下游信號通路的激活與RA 關(guān)節(jié)病變過程密切相關(guān)。

HMGB1識別并上調(diào)體外培養(yǎng)SFs 上的TLRs 及RAGE 受體，進而激活下游NF-κB、p38 MAPK等炎癥相關(guān)性信號通路，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子（TNF、IL-1β、INF-γ 和IL-6等）、趨化因子（CCL2、CXCLl2）、黏附分子（ICAM、VCAM）及MMPs 的異常表達；激活下游自噬相關(guān)信號通路Akt-mTOR，促進Ptdins3KC3與Beclinl 結(jié)合，直接導(dǎo)致細(xì)胞的自噬增強、凋亡減少和增生活躍，進一步放大其病理效應(yīng)。HMGB1可體外誘導(dǎo)OASFs 轉(zhuǎn)化的RASFs 樣細(xì)胞，變形轉(zhuǎn)變后其具有明顯的致病性，可大量分泌MMPs 對軟骨造成損傷，其生物學(xué)效應(yīng)與RASFs 細(xì)胞類似。

綜上所述，RA 是骨關(guān)節(jié)科以及風(fēng)濕免疫科臨床工作中常見的自身免疫性疾病。病程中后期，關(guān)節(jié)病變所致的疼痛與關(guān)節(jié)畸形嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。對與病情穩(wěn)定的非活動期RA 患者，除關(guān)節(jié)置換外目前尚無有效治療方案。HMGB1是一種潛在的炎癥誘導(dǎo)因素，其與RA 的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，是RA 發(fā)生、發(fā)展這一生物學(xué)行為的關(guān)鍵調(diào)控分子，故而HMGBl 以及RASFs 在RA 中的作用有重要意義。但相關(guān)機制仍不完全清楚，隨著研究的深入，HMGB1將進一步解讀RA 致病機制，為臨床治療RA 帶來希望。