王秀英
(遼寧省鐵嶺縣凡河動物衛(wèi)生監(jiān)督所 112600)
恒溫箱、微生物接種用具、微量移液器、營養(yǎng)瓊脂、伊紅美蘭培養(yǎng)基、乳糖膽鹽培養(yǎng)基、試管、童氏小管、溴甲酚紫試劑等。
來源于鐵嶺市種雞場近期未用藥自然發(fā)病雞的病料分離培養(yǎng),經(jīng)生化試驗和血清學檢查確定為致病性大腸桿菌,并在培養(yǎng)基中多次繼代培養(yǎng)。
自制藥敏紙片,每片含硫酸慶大霉素20μg[1]。
采用K-B 法在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上涂布法接種試驗用大腸桿菌,置恒溫箱中37℃培養(yǎng)24h,取出觀察結(jié)果,并進行抑菌敏感性讀數(shù)。
根據(jù)大腸桿菌的耐藥產(chǎn)生機制,通過不斷適應抗菌藥物環(huán)境,進行耐藥誘導試驗。操作方法如下。
(1)取試管8 支。分別乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)。第一支4.9ml,2~9 支4.5ml。
(2)倒置童氏小管,排出氣體,滴0.05%溴甲酚紫指示劑2 滴,高壓滅菌20min,備用。
(3)第1 支液體培養(yǎng)基中用微量移液器加入10%硫酸慶大霉素100μl,反復吹打混合均勻,即為慶大霉素2mg/ml 有效濃度,吸出500μl,加入第2 支培養(yǎng)基中,混合均勻,再吸出500μl 至第3 管,以此10 倍梯度稀釋有效濃度硫酸慶大霉素操作至第7 管,混合均勻,吸出500μl 丟棄不用。第8 去做對照。粘貼標簽,標記各試管中硫酸慶大霉素濃度。
(4)用微量移液器無菌操作向每只試管液體培養(yǎng)基中接種大腸桿菌菌液,搖勻。
(5)置恒溫箱中37℃培養(yǎng)24h,取出觀察結(jié)果,觀察培養(yǎng)基色澤變化和童氏小管中氣體產(chǎn)生量,判定細菌是否生長。
(1)將耐藥誘導試驗中略微開始生長的試管菌種繼續(xù)接種同一濃度乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng),無藥乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基接種作空白對照。
(2)當大腸桿菌逐漸適應抗菌藥物環(huán)境生長良好或接近空白對照生長程度時,移接下一個10 倍梯度的慶大霉素乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng),同時和空白培養(yǎng)對照。記錄繼代培養(yǎng)代數(shù)。
(3)大腸桿菌在某一濃度慶大霉素中適應,產(chǎn)生耐藥,生長良好后,即可移接到下一個10 倍梯度的慶大霉素乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基中,直到無法適應,不再良好生長為止。記錄繼代培養(yǎng)代數(shù)和慶大霉素濃度。
(4)保留末代耐藥菌種進行下一步試驗,同時將末代菌種用K-B 法在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進行藥敏試驗和抑菌敏感性讀數(shù)。
(1)末代耐藥大腸桿菌菌種移接至無藥的乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)。每偶數(shù)代培養(yǎng)后進行1 次K-B 法藥敏試驗,分別移接至4lg 和3lg 慶大霉素乳糖膽鹽肉湯中培養(yǎng),記錄繼代培養(yǎng)代數(shù)、生長情況和藥敏試驗數(shù)據(jù)。
(2)大腸桿菌對慶大霉素性不斷的恢復,至最大數(shù)據(jù)時停止試驗,記錄恢復培養(yǎng)代數(shù)和最后恢復菌種的藥敏試驗數(shù)據(jù)。
(1)慶大霉素最低抗菌濃度試驗結(jié)果表明,在4log10 (以下簡寫lg)有效濃度時不能完全抑制大腸桿菌,即開始生長,慶大霉素對大腸桿菌最小抑菌濃度(MIC)為0.02μg/ml。
(2)耐藥誘導試驗中,大腸桿菌在4lg 有效濃度慶大霉素中逐漸適應產(chǎn)生藥性,在下一個10 倍梯度的慶大霉素環(huán)境中迅速適應,繼續(xù)產(chǎn)生耐藥性,在2log10 有效濃度的慶大霉素環(huán)境中無法繼續(xù)適應,耐藥性達到最大程度,耐藥性不再增強。大腸桿菌對慶大霉素敏感性明顯下降,由高敏變成低敏。
(3)根據(jù)耐藥誘導試驗結(jié)果,將2lg 有效濃度的慶大霉素環(huán)境中大腸桿菌作為試驗菌種進行敏感性恢復試驗。大腸桿菌在無藥的培養(yǎng)環(huán)境中對慶大霉素的敏感性開始緩慢恢復,之后迅速恢復,接近試驗前的敏感程度。
(4)在無藥環(huán)境中對大腸桿菌繼代培養(yǎng)進行敏感性恢復結(jié)果表明,初期大腸桿菌對慶大霉素的敏感性恢復緩慢,經(jīng)過一段時間后短時間即迅速恢復對慶大霉素的敏感性,由低敏恢復到高敏程度,幾乎接近初始狀態(tài)。
(1)慶大霉素對大腸桿菌最小抑菌濃度(MIC)為0.02μg/ml,在防治用藥無效時可檢驗體內(nèi)慶大霉素含量,其含量應至少相當于10 倍MIC,即0.2μg/ml 才能達到抗菌目的。
(2)大腸桿菌對慶大霉素容易產(chǎn)生耐藥性,一旦對慶大霉素適應,迅速產(chǎn)生耐藥性。在無藥的情況下能很快恢復對慶大霉素的敏感性。因此,在臨床防治中不可長期使用慶大霉素,通常突擊性使用一個療程,以免產(chǎn)生耐藥,出現(xiàn)耐藥后停止應用氨基糖苷類藥物一段時間即可恢復敏感性[2]。長遠來看,慶大霉素仍然是治療大腸桿菌的一種有效藥物。