李濤，吳越

（ 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1. 神經(jīng)外科；2. 麻醉科，遼寧 大連 116011）

加巴噴丁是γ-氨基丁酸衍生物，近年來臨床上用于慢性疼痛 （尤其是神經(jīng)病理性疼痛） 的治療。研究［1］顯示不同病因的神經(jīng)病理性痛其治療效果也不同。神經(jīng)病理性疼痛的動物模型常用脊神經(jīng)結(jié)扎 （spinal nerve ligation，SNL） 模型，SNL能直接誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛［2］。TANGA等［3］2005年首次發(fā)現(xiàn)Toll樣受體4 （Toll like receptor 4，TLR4） 在神經(jīng)病理性疼痛模型中發(fā)揮重要作用。有研究［4］報道TLR4抑制劑FP-1能夠降低大鼠外周神經(jīng)損傷所引起的疼痛。已有研究［5］證明加巴噴丁能夠抑制糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié) （dorsal root ganglion，DRG） 中TLR4的表達(dá)，從而緩解糖尿病大鼠的神經(jīng)病理性疼痛。本研究探討加巴噴丁對大鼠神經(jīng)病理性痛的作用及其對DRG中TLR4表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑、動物及分組

TLR4小鼠一抗 （美國Abcam公司）、β-actin抗體 （美國Cell Signaling公司）、 BCA 蛋白分析試劑盒 （中國碧云天公司）。加巴噴丁 （美國Sigma Aldrich公司，CAS編號：60142-96-3） 制備生理鹽水溶液 （50 mg/kg） 供腹腔注射應(yīng)用。雌性SD大鼠36只，體質(zhì)量200～220 g，由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實驗中心提供。正常室溫喂養(yǎng)，照明/黑暗各12 h。動物使用遵照大連醫(yī)科大學(xué)動物管理委員會要求。大鼠隨機(jī)均分為3組：假手術(shù)組 （Sham 組）、SNL組和加巴噴丁 （GBP組），每組12只。

1.2 SNL大鼠模型制備及手術(shù)操作

SNL組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉 （50 mg/kg） 麻醉后，在左側(cè)L4-6沿脊柱切開皮膚，分離肌肉，暴露出L6脊椎橫突，使用4-0醫(yī)用縫合線在近段結(jié)扎L5脊神經(jīng)，然后剪斷遠(yuǎn)端，最后將肌肉皮膚依次縫合。Sham組大鼠除不結(jié)扎L5脊神經(jīng)，其他操作與SNL組相同。GBP組大鼠的手術(shù)操作與SNL組相同，并行手術(shù)完成時腹腔注射加巴噴丁 （50 mg/kg）。

1.3 大鼠機(jī)械疼痛閾值測定

在術(shù)后第1、3、5、7、14天，使用機(jī)械縮足閾值 （mechanical withdrawal threshold，MWT） 來測量大鼠機(jī)械疼痛程度。將大鼠放在1個有機(jī)玻璃盒中 （12 cm×12 cm×16 cm），有機(jī)玻璃盒放置于金屬網(wǎng)上 （0.5 cm×0.5 cm）。使用Von Frey絲 （直徑200μm） 垂直扎大鼠的左足底，當(dāng)大鼠后足突然揚(yáng)足、縮足或舔足為陽性。刺激間隔8 min，重復(fù)5次，計算平均值。

1.4 大鼠熱痛閾值測定

分別在手術(shù)前，手術(shù)后1、3、5、7 d檢測大鼠后足對熱痛刺激的反應(yīng)。通過檢測大鼠后足底對熱刺激產(chǎn)生的縮腿動作時間 （thermal withdrawal latency，TWL） 來測量熱痛閾值。將大鼠獨(dú)自放在底部厚度為0.2 mm的有機(jī)玻璃盒 （18 cm×18cm×36cm） 中，適應(yīng)環(huán)境20 min后，使用熱輻射疼痛刺激器 （BME-410C，天津伯爾尼科技有限公司） 在玻璃板下10 cm聚焦大鼠后足底，當(dāng)大鼠產(chǎn)生縮足或舔足反應(yīng)停止照射，記錄起止時間。間隔時間＞8 min，重復(fù)5次，取平均值作為TWL。為防止大鼠足底皮膚損傷，設(shè)定最高閾值為20 s。

1.5 Western blotting 檢測

術(shù)后7 d大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉 （50 mg/kg） 麻醉后，斷頭處死，于冰上快速取L3～5DRG。使用勻漿器，加入蛋白裂解液，將DRG勻漿裂解20 min后，用移液器將蛋白裂解液移至1.5 mL EP管中，4 ℃高速離心15 min后，取上清液，采用BCA法檢測樣品蛋白濃度，用裂解液配平。加入5×上樣緩沖液，煮沸8 min。上樣電泳，濃縮膠80V 40 min，分離膠120 V 80 min，轉(zhuǎn)膜 100V 60 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5% 脫脂奶粉封閉1 h后，一抗anti-TLR4 （1∶100），anti-β-actin （1∶5 000），4 ℃孵育過夜；室溫TBST洗3次，5 min/次，加入HRP兔抗鼠二抗 （1∶1 000），室溫孵育1 h；TBST洗3次，5 min/次；ECL發(fā)光液發(fā)光。計算成像后蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠MWT、TWL比較

結(jié)果顯示，大鼠進(jìn)行SNL手術(shù)前MWT的基礎(chǔ)閾值是20.5 g。與Sham組比較，SNL組、GBP組大鼠手術(shù)1、3、5、7 d后MWT持續(xù)降低 （P ＜ 0.05），具有時間依賴性；與SNL組比較，GBP組大鼠手術(shù)3、5、7 d后MWT明顯升高 （P ＜ 0.05）。見表1。

術(shù)前1 d大鼠TWL Sham 組 （12.28±0.8）、SNL組 （11.96±0.7）、GBP組 （12.64±0.8） 比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 （均P ＞ 0.05）。與術(shù)前1 d比較，Sham組 （1、3、5、7 d），SNL組和GBP組大鼠 （1，3 d） TWL比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＞ 0.05）。與Sham組比較，SNL組、GBP組大鼠術(shù)后5、7 dTWL均降低 （P ＜ 0.05） ；與SNL組比較，GBP組術(shù)后5、7 dTWL升高 （P ＜ 0.05），見表1。

2.2 各組大鼠 Western blotting 檢測結(jié)果

結(jié)果顯示， Sham組、 SNL組、 GBP組大鼠DRG中TLR4表達(dá)分別為1.0±0.0、1.9±0.6、1.2±0.5。與Sham組比較，SNL組TLR4表達(dá)明顯增加 （P ＜ 0.01） ；而GBP組TLR4表達(dá)無明顯變化 （P ＞ 0.05） ；與SNL組比較，GBP組TLR4表達(dá)顯著減少 （P ＜ 0.01）。見圖1。

3 討論

加巴噴丁是一種新型用于治療神經(jīng)病理性疼痛的藥物，但其緩解疼痛的機(jī)制尚不明確。研究［3］表明TLR4在疼痛的產(chǎn)生中發(fā)揮重要的作用，TLR4拮抗劑能緩解神經(jīng)病理性疼痛。有研究［6］表明，TLR4在神經(jīng)病理性疼痛動物模型中發(fā)揮重要作用，與肽類和非肽類DRG初級感覺神經(jīng)元共表達(dá)，并與神經(jīng)元興奮性的增高相關(guān)。TLR4下游信號通路核轉(zhuǎn)錄因子、P38 MAPK參與痛覺過敏的形成過程［7］。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)扎L5脊神經(jīng)能夠激活TLR4 相關(guān)的痛覺敏化通路，表明TLR4在SNL引起疼痛中起著重要的作用。SNL大鼠DRG中TLR4表達(dá)增加，TLR4可能與SNL誘發(fā)的疼痛相關(guān)，加巴噴丁可以降低DRG中TLR4表達(dá)，有可能通過阻斷TLR4的下游通路發(fā)揮緩解疼痛的作用，其可能機(jī)制是在大鼠神經(jīng)病理性疼痛的模型中，通過抑制TLR4下游的MyD88依賴性信號通路來緩解神經(jīng)病理性疼痛［8］。另有研究［9-10］表明脊髓中ANXA0/NF-kB/MMP-9信號通路與前炎癥細(xì)胞因子活化在SNL誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用；SNL （L5結(jié)扎） 模型L5DRG中Nav1.7蛋白表達(dá)降低［10］。

綜上所述，加巴噴丁能夠緩解神經(jīng)病理性疼痛，降低SNL大鼠DRG中TLR4表達(dá)。TLR4是天然免疫反應(yīng)的第一道防線，其下游具有復(fù)雜的信號通路，加巴噴丁如何影響信號通路仍不清楚，需要進(jìn)一步研究論證。