孫 靜，陳 明，孟家松，張克亮，陶 俊

(揚州大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院/江蘇省作物遺傳生理重點實驗室，江蘇 揚州 225009)

脂肪酸去飽和酶(FAD)是植物脂肪代謝的關(guān)鍵酶，它能促使脂肪酸轉(zhuǎn)化為不飽和脂肪酸。目前，人們已經(jīng)通過對擬南芥等植物的研究，分離出多種參與脂肪酸去飽和代謝過程中相關(guān)酶的編碼基因，分別為FAD2、FAD3、FAD6、FAD7、FAD8[1]。根據(jù)雙鍵位置的不同，將其分為△9脂肪酸去飽和酶、△12脂肪酸去飽和酶和△15脂肪酸去飽和酶[2-4]。其中，△9脂肪酸去飽和酶是唯一可溶的去飽和酶，它僅包括硬脂酰(18∶0)-ACP去飽和酶(Stearoyl-ACP desaturase，SAD)，△12脂肪酸去飽和酶和△15脂肪酸去飽和酶為膜蛋白[1]，編碼△12脂肪酸去飽和酶的基因有FAD2、FAD6，編碼△15脂肪酸去飽和酶的基因有FAD3、FAD7、FAD8[5-7]。

FAD2基因編碼的△12脂肪酸去飽和酶是合成不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶，也是植物合成不飽和脂肪酸的限速酶。FAD2位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，主要催化脂肪酸鏈第12位和第13位碳原子之間形成雙鍵，將油酸轉(zhuǎn)化成亞油酸，使油酸能夠進一步去飽和[8-10]。目前，人們已經(jīng)從很多植物中克隆出FAD2的基因序列[11-18]，在擬南芥等少數(shù)植物中，只含有1個FAD2基因，而在其他大多數(shù)植物中發(fā)現(xiàn)有多個FAD2基因。如大豆中有4個，油橄欖中有2個，玉米中有3個。同一物種中FAD2基因不同，其作用也不盡相同。由于在種子油脂儲存和植物質(zhì)膜構(gòu)成中均有多不飽和脂肪酸參與，因此可將不同F(xiàn)AD2基因分為種子儲存油脂的種子特異型和維持細(xì)胞質(zhì)膜脂肪酸代謝所需要的組成型2種。

鳳丹(PaeoniaostiiT. Hong & J. X. Zhang)又名銅陵牡丹、銅陵鳳丹，產(chǎn)自安徽省銅陵縣鳳凰山，芍藥科芍藥屬，屬于油用牡丹的主要品種。近年來，人們發(fā)現(xiàn)鳳丹中α-亞麻酸含量特別高，作為一種新型的油料作物，分離牡丹植物中的FAD2基因，研究其表達(dá)模式是十分必要的。目前，少有研究報道鳳丹PoFAD2基因的表達(dá)模式及功能，查閱文獻后發(fā)現(xiàn)，宋淑香[19]曾做過一些研究。

本研究擬對PoFAD2新成員進行克隆和生物信息學(xué)分析，及其在植物體不同部位和時期的相對表達(dá)分析，以期進一步探究PoFAD2在鳳丹中的作用，為牡丹種子高α-亞麻酸含量的進一步研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用江蘇省揚州市揚州大學(xué)牡丹種質(zhì)資源圃(32°23′N，119°24′E)種植的鳳丹為試驗材料，采集盛花期的根、莖、葉、花、子房及種子(花后40 d、60 d、80 d、100 d、120 d)，立即置于液氮中速凍，-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，pMD19-T載體、TaqDNA聚合酶、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 按照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒說明書提取鳳丹種子及葉片的總RNA，提取RNA后，取1 μl進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測其質(zhì)量及濃度，剩余的保存在-80 ℃冰箱中。cDNA第一鏈的合成利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)完成。

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI報道的鳳丹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(登錄號：SRP051810)，篩選到PoFAD2-1和PoFAD2-2 2個基因序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物PoFAD2-1F：5′-CAATGGGAGCCGGTGGTCGAATGGC-3′和PoFAD2-1R：5′-ACTCGTTCCGATACCAAAACACACC-3′以及PoFAD2-2F：5′-ATTGTGGAACAATGGGTGCCGGTGG-3′和PoFAD2-2R：5′-TTATTCAAACTTATTCTTGTACCAG-3′，擴增鳳丹PoFAD2-1、PoFAD2-2基因的開放閱讀框(ORF)。

1.2.3 鳳丹PoFAD2-2基因全長的獲得 利用設(shè)計的引物對PoFAD2-1和PoFAD2-2的cDNA進行擴增，采用1%瓊脂糖凝膠電泳對2次擴增的PCR產(chǎn)物進行檢測，目的條帶采用MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)進行回收，然后采用pEASYTM-T5 Zero Cloning Kit試劑盒(全式金公司產(chǎn)品)進行TA克隆，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α體內(nèi)，然后進行抗生素(氨芐西林)篩選，抗生素質(zhì)量濃度為100 mg/ml。最后將陽性克隆送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 cDNA全長的開放閱讀框及編碼氨基酸利用Bioedit軟件來預(yù)測。利用生物學(xué)軟件DNAMAN5.0進行序列的拼接和翻譯，利用在線工具NCBI Blast進行序列的同源性比對，并采用MEGA5.0的鄰接法(NJ)利用獲得基因?qū)ⅧP丹與目前主要的幾個油料作物進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。利用軟件Prot Param、Prot Scale、TMHMM2.0、SMART分別對基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、保守功能域進行分析。

1.2.5 基因表達(dá)模式的分析 利用熒光定量PCR儀CFX96 Reak Time System(Bio-Rad公司產(chǎn)品)，采用實時定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析PoFAD2-2基因在鳳丹根、莖、葉、花、子房和種子中的表達(dá)差異，并與PoFAD2-1做對比。實時定量PCR采用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)，內(nèi)參為鳳丹的ubiquitin基因，特異性表達(dá)引物如表1顯示。擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。使用Bio-Rad CFX Manager V1.6.541.1028軟件收集反應(yīng)的Ct值。每個樣品重復(fù)3次，最終結(jié)果采用2-△△Ct法[20]進行計算。

表1鳳丹PoFAD2-1、PoFAD2-2基因克隆所用引物及其序列

Table1PrimersandsequenceofPoFAD2-1andPoFAD2-2genecloning

2 結(jié)果與分析

2.1 鳳丹PoFAD2-2基因克隆及序列分析

以鳳丹葉片cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增后獲得基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果與預(yù)期相符，測序后經(jīng)Blast比對確定其為鳳丹PoFAD2-2基因。序列分析結(jié)果表明，該基因OFR全長為1 155 bp，編碼384個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為44 000，等電點為8.51。

為對比PoFAD2-1與PoFAD2-2序列上的差異，用DNAMAN軟件對PoFAD2-1及PoFAD2-2基因編碼的氨基酸進行氨基酸組成與數(shù)目對比以及氨基酸序列比對(圖1)。

表2顯示，PoFAD2-1編碼的氨基酸序列長度為383，酸性氨基酸及酰胺個數(shù)為52，堿性帶正電荷的R基氨基酸個數(shù)為55。PoFAD2-2編碼的氨基酸序列長度為384，酸性氨基酸及酰胺個數(shù)為50，堿性帶正電荷的R基氨基酸個數(shù)為57。2個基因編碼的氨基酸一致性為77.43%，相似性一般。

為了探討鳳丹PoFAD2-1基因、PoFAD2-2基因與其他植物同類基因的親緣關(guān)系及可能的作用方式，用MEGA軟件對PoFAD2-1和PoFAD2-2基因編碼的氨基酸序列與柑橘、油茶、大豆、南瓜等已報道24個物種FAD2基因編碼的氨基酸序列進行比對，構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹，設(shè)定重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000。聚類分析結(jié)果(圖2)表明，對于PoFAD2-1基因，鳳丹在進化上與油茶[Camelliaoleifera(KJ995981.1)]、珙桐[Davidiainvolucrata(EU275211.1)]、毛果楊[Populustrichocarpa(Populusbalsamiferasubsp.trichocarpa) (XM_002297624.2)]、歐榛[Corylusavellana(KF856626.1)]、大豆[Glycinemax(soybean) (AY954300.1)]、大豆[Glycinemax(soybean) (BT098510.1)]的親緣關(guān)系較近。對于PoFAD2-2基因，鳳丹在進化上與油橄欖[Oleaeuropaea(common olive) (KY652929.1)]、靛木[Wrightiatinctoria(GU190864.1)]具有較高的相似性。PoFAD2-1與PoFAD2-2親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表2PoFAD2-1和PoFAD2-2基因編碼的氨基酸組成及數(shù)目

Table2AminoacidcompositionandnumberofproductsencodedbyPoFAD2-1andPoFAD2-2genes

氨基酸 數(shù)目PoFAD2-1PoFAD2-2氨基酸 數(shù)目PoFAD2-1PoFAD2-2丙氨酸2325亮氨酸3837精氨酸1616賴氨酸1520天冬酰胺1310甲硫氨酸85天冬氨酸1721苯丙氨酸2025半胱氨酸66脯氨酸2625谷氨酰胺68絲氨酸2424谷氨酸1611蘇氨酸1920甘氨酸2225色氨酸1312組氨酸2421酪氨酸2825異亮氨酸1618纈氨酸3330

圖1 鳳丹PoFAD2-1與PoFAD2-2蛋白質(zhì)氨基酸序列對比Fig.1 Amino acid sequences comparison of PoFAD2-1 and PoFAD2-2

圖2 鳳丹PoFAD2-1和PoFAD2-2系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of PoFAD2-1 and PoFAD2-2

2.2 PoFAD2-2生物信息學(xué)分析

用NCBI軟件對PoFAD2-2的保守結(jié)構(gòu)域進行分析，用TMHMM軟件對PoFAD2-2的跨膜結(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)果(圖3)表明，PoFAD2-2蛋白質(zhì)屬于膜結(jié)合型的FAD超家族，在第 105～110個氨基酸位點、第 140～145個氨基酸位點、第 315～320氨基酸位點3處共有3個可能的Fe2+結(jié)合位點，可能起催化作用。PoFAD2-2有5個跨膜結(jié)構(gòu)域，分別為 49～71、81～102、179～196、223～245、250～272位的氨基酸，第5個跨膜區(qū)疏水性較強。

圖3 PoFAD2-2編碼蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域(a)和跨膜結(jié)構(gòu)域(b)分析Fig.3 Analysis of the conserved domain of PoFAD2-2-encoded proteins (a) and transmembrane domain (b)

2.3 PoFAD2疏水性分析

利用Hydrophobicity ProtScale軟件預(yù)測PoFAD2蛋白質(zhì)的疏水性。圖4顯示，PoFAD2-2基因所編碼的蛋白質(zhì)疏水性最小為-3.244，最大值為2.744，說明該蛋白質(zhì)為偏親水性蛋白質(zhì)。其中49～102、179～272位的氨基酸殘基區(qū)域構(gòu)成了2個疏水性區(qū)域，1～48、103～178、273～384位的氨基酸殘基區(qū)域構(gòu)成了3個親水性區(qū)域。

圖4 PoFAD2-2基因編碼蛋白質(zhì)的疏水性Fig.4 Hydrophobicity analysis of the protein encoded by the PoFAD2-2 gene

2.4 鳳丹PoFAD2-1和PoFAD2-2基因在植株不同組織中的表達(dá)分析

采用qRT-PCR方法測量了PoFAD2-1和PoFAD2-2在鳳丹根、莖、葉、花、子房、種子中的表達(dá)量，以及開花后40 d、60 d、80 d、100 d、120 d時PoFAD2-1和PoFAD2-2在種子中的表達(dá)量。圖5顯示，PoFAD2-1在鳳丹的根、莖、葉、花、子房、種子中均有表達(dá)，而PoFAD2-2在根和子房中沒有表達(dá)。PoFAD2-1主要在子房和種子中表達(dá)，PoFAD2-2主要在花和葉表達(dá)。隨著種子逐漸成熟，PoFAD2-1和PoFAD2-2在種子中的表達(dá)量均是先降低再升高然后再降低，PoFAD2-1表達(dá)量在100 d升高，而PoFAD2-2表達(dá)量在80 d升高。PoFAD2-2在種子中不同時期的表達(dá)量均低于PoFAD2-1(圖5)。

3 討 論

脂肪酸有飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸又分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。油酸作為單不飽和脂肪酸同飽和脂肪酸一樣能由人體合成，而亞油酸則需要從食物中獲取。亞油酸是單不飽和油酸轉(zhuǎn)化為多不飽和酸的第一步中間產(chǎn)物，因此，F(xiàn)AD2基因作為將油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸的關(guān)鍵基因，是非常重要的。

關(guān)于FAD2基因的研究很多，人們已經(jīng)從芝麻、橄欖樹、油茶、文冠果、油葵、黃瓜、油桐、花生等植物中克隆出FAD2基因，而且這些植物中大多不止1個FAD2基因。在黃瓜中發(fā)現(xiàn)了2個不同拷貝的FAD2基因[21]，從花生中分離出了6個不同拷貝的FAD2基因[22]。不同F(xiàn)AD2基因在植物體中的作用可能也不同。它們在序列特點、表達(dá)調(diào)控和功能機理方面都存在著顯著差異[23-24]。王仲偉等[25]發(fā)現(xiàn)，油茶CoFAD2-2基因的表達(dá)模式比較特異，在開花后42周到44周之間(油茶種子趨于成熟)高表達(dá)，其他階段表達(dá)水平一直維持在較低水平，尤其在種子成熟后期趨于更低水平的表達(dá)。Liu等[26]發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，棉花FAD2-2基因表達(dá)量顯著升高，而FAD2-3基因的表達(dá)則被抑制，F(xiàn)AD2-4和FAD2-5基因的表達(dá)量只是輕微上升。Hernández等[16]發(fā)現(xiàn)，油橄欖中的FAD2-1使幼小種子中儲存的脂質(zhì)去飽和，而FAD2-2使成熟的種子和中果皮中的脂肪去飽和。Suresha等[27]指出，F(xiàn)AD2在芥菜的所有組織中表達(dá)，在油的合成過程中受到調(diào)控。FAD2-1和FAD2-3-1在亞麻薺中的表達(dá)主要集中在花和種子上[28]。對花生中FAD2轉(zhuǎn)錄本分布進行分析，發(fā)現(xiàn)FAD2-1基因在發(fā)育種子中的表達(dá)量比FAD2-2基因高70倍，但是FAD2-2基因在花中大量表達(dá)[22]。

根據(jù)FAD2基因的位置和表達(dá)模式將它分為4種類型，即FAD2-1、FAD2-2、FAD2-3和FAD2-4。FAD2基因的4個變異顯示出高度的序列相似性，但在脂肪酸修飾中的表達(dá)模式和功能存在差異[29]。FAD2-1是一種種子特異性去飽和酶，可合成幼苗和花芽中的多不飽和脂肪酸[30]。FAD2-2基因在大豆的營養(yǎng)組織和整個種子發(fā)育中呈組成型表達(dá)[31]。FAD2-2是負(fù)責(zé)亞油酸合成的主要基因[32]。幾乎在所有組織中FAD2-3和FAD2-4均主要合成多不飽和脂肪酸。據(jù)報道，F(xiàn)AD2-3多肽與FAD2-4多肽具有98%的相似性[33]。

PoFAD2-1基因在花中表達(dá)量最低，在子房中表達(dá)量最高，在花后40 d、60 d、80 d、100 d、120 d的種子中PoFAD2-1表達(dá)量分別為PoFAD2-2的8.8倍、5.7倍、2.8倍、9.0倍、1.0倍，而且在種子發(fā)育進程中，剛開始表達(dá)量比較高，然后快速下降，在花后80 d時又開始上升，花后100 d又急劇下降。這與宋淑香[19]所測的鳳丹PoFAD2-1熒光定量結(jié)果相似。PoFAD2-1基因表達(dá)量在種子發(fā)育100 d時開始急劇下降，這與鳳丹不飽和脂肪酸含量在種子發(fā)育100 d時最高，隨后不飽和脂肪酸含量又下降的趨勢一致[19]。說明，PoFAD2-1基因確實是種子特異性基因。

本研究發(fā)現(xiàn)，PoFAD2-2基因在鳳丹莖、葉、花、種子中均有表達(dá)，在根、子房中卻沒有表達(dá)，在種子整個發(fā)育期中的表達(dá)量都很低，在花中的表達(dá)量最高，說明此基因表達(dá)具有組織特異性。PoFAD2-2基因在種子發(fā)育進程中的表達(dá)趨勢與PoFAD2-1相同。而PoFAD2-2基因在葉和花中的表達(dá)量都較高，分別是PoFAD2-1表達(dá)量的8.4倍、71.0倍。這可能是因為PoFAD2-2基因是負(fù)責(zé)亞油酸合成的主要基因。