戴忠良，陳 麗，山 溪，秦文斌，肖 燕，朱建飛

(1.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇 句容 212400；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095)

甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL.)為十字花科蕓薹屬的重要蔬菜作物，在中國(guó)廣泛種植。抽薹開(kāi)花是其生產(chǎn)中重要的農(nóng)藝性狀?！跋绕诔檗贰苯档彤a(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)，是春季結(jié)球甘藍(lán)生產(chǎn)的主要問(wèn)題。培育晚抽薹品種是解決這一問(wèn)題的根本途徑[1-2]。

FLC是開(kāi)花時(shí)間調(diào)控的開(kāi)關(guān)基因，對(duì)擬南芥開(kāi)花控制有決定性的作用[3-4]。該基因在白菜類作物中有4個(gè)同源基因，但這些同源基因如何調(diào)控抽薹，以及它們與其他主要的抽薹開(kāi)花相關(guān)基因的相互關(guān)系尚不明確。FLC編碼1個(gè)MADS-box蛋白,是開(kāi)花的負(fù)調(diào)控因子，很多控制開(kāi)花的基因功能都是通過(guò)調(diào)節(jié)FLC來(lái)實(shí)現(xiàn)的，對(duì)開(kāi)花的抑制程度與其表達(dá)量呈正相關(guān)[4]。FLC可能通過(guò)阻遏開(kāi)花信號(hào)途徑來(lái)抑制植物的生殖生長(zhǎng)。在擬南芥中，己經(jīng)克隆到了一些與FLC同源的基因，如MAF5、FLM、MF2和FLK等，它們?cè)谥参镩_(kāi)花過(guò)程中也起著負(fù)調(diào)控作用[5]。FLC及其同源基因抑制一組開(kāi)花促進(jìn)因子的表達(dá)，如FT和SOC1，這些因子的表達(dá)又能夠促進(jìn)一些分生組織特征基因LFY與AP1的表達(dá)[4]。FLC是開(kāi)花調(diào)控過(guò)程中起決定因素的一個(gè)調(diào)控因子，它受GA、光周期、春化與自主途徑的負(fù)調(diào)控，受FRI-依賴途徑的正調(diào)控[6]。遺傳與分子生物學(xué)研究結(jié)果表明，F(xiàn)RI自主途徑可能是通過(guò)與SUF4等形成蛋白復(fù)合體結(jié)合到FLC啟動(dòng)子的區(qū)域，來(lái)影響FLC的染色體結(jié)構(gòu)；春化可使FLC的第一個(gè)內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)H3K9和H3K27二甲基化水平增加，使得FLC的染色體結(jié)構(gòu)處于關(guān)閉狀態(tài)，從而調(diào)控FLC的表達(dá)[7]。為了更好地利用這些基因?qū)Ω仕{(lán)抽薹開(kāi)花進(jìn)行調(diào)控，本試驗(yàn)克隆了與抽薹相關(guān)的基因BoFLC3的全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行序列分析以及時(shí)空特異性表達(dá)和亞細(xì)胞定位分析，為進(jìn)一步利用該基因進(jìn)行甘藍(lán)抽薹的調(diào)控提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料與菌株

供試甘藍(lán)種子由鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。大腸桿菌菌株JM109由本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒載體pMD18-T、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、RNA酶抑制劑、dNTP、AMV反轉(zhuǎn)錄酶等均購(gòu)自TaKaRa公司。RNA提取試劑盒(RNA Simply Total RNA Kit)購(gòu)自TIANGEN BIOTECH公司；Biospin膠回收試劑盒(BioSpin Gel Extraction Kit)購(gòu)自博飛公司；SYBRPremixExTaqTM試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 BoFLC3基因克隆

以甘藍(lán)葉片cDNA為模板，參照甘藍(lán)FLC3基因(GenBank登錄號(hào)AAP31677)，設(shè)計(jì)正反向引物BoFLC3-F/BoFLC3-R(表1)，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為25.00 μl，其中加入10×Taqplus buffer 2.50 μl，25 mmol/L MgCl21.50 μl，10 mmol/L dNTP 1.00 μl，10 μmol/L正向引物1.00 μl，10 μmol/L反向引物1.00 μl，菌液1.00 μl，滅菌H2O 16.75 μl，Taqplus DNA polymerase 0.25 μl(5 U/μl)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照及分析。

表1甘藍(lán)BoFLC3基因克隆引物

Table1PrimersforthecloningofBoFLC3geneinBrassicaoleracea

引物 引物序列 作用 BoFLC3-F5'-ATGGGAAGAAAAAAACTAGAAATCA-3'基因全長(zhǎng)克隆BoFLC3-R5'-TCAGCTTCGGCTCCCGCAAGATTCT-3'BoFLC3-qF5'-ACCTTCTCCAAACGACGCA-3'熒光實(shí)時(shí)定量引物BoFLC3-qR5'-AGACAACGAGAAGCGCGATG-3'GAPDH-qF5'-TCCACCATTGATTCTTCTCTG-3'熒光實(shí)時(shí)定量?jī)?nèi)標(biāo)引物GAPDH-qR5'-TCAGCCAAATCAACAACTCTC-3'

1.3 目的片段回收

目的片段的回收按照購(gòu)自博飛公司的Biospin膠回收試劑盒(BioSpin Gel Extraction Kit)使用說(shuō)明進(jìn)行。參照TaKaRa生物公司的pMD18-T kit提供的方法，向10 μl的反應(yīng)總體系中加入1 μl pMD18-T vector,4 μl回收并純化的DNA片段以及5 μl Ligation solution Ⅰ，于16 ℃連接過(guò)夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用高溫高壓滅菌的牙簽挑取單菌落，將挑過(guò)菌的牙簽置于2 ml LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h。序列測(cè)定由南京金思特生物科技有限公司完成。

1.4 序列分析

通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)服務(wù)器，對(duì)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST搜索，尋找同源序列。將編碼的氨基酸序列用NCBI提供的BlastP程序進(jìn)行同源性分析，用DNAman軟件對(duì)BoFLC3編碼的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)樹(shù)分析，利用ProtParam[8]分析BoFLC3蛋白的理化性質(zhì)，利用TMpred[9]和ANTHEPROT分析軟件分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域，利用ProtScale[8]分析蛋白質(zhì)的親水性區(qū)域，用SignalP v3.0[9]進(jìn)行信號(hào)肽分析，利用SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)甘藍(lán)BoFLC3蛋白進(jìn)行功能域預(yù)測(cè)分析，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和三維建模分別使用在線軟件SOPMA(http://npsa-pbi.libcp. fr/cgi-bin/secpred-sopma. pl)和SWISS-MODEL完成。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR分析

將甘藍(lán)材料播種于裝有經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌的基質(zhì)的穴盤中，將穴盤置于光照12 h、黑暗12 h光周期的光照培養(yǎng)箱中，夜溫20 ℃、晝溫25 ℃下培養(yǎng)。待幼苗長(zhǎng)至2片真葉時(shí)用于試驗(yàn)。本試驗(yàn)用GAPDH為內(nèi)參基因(表1)，每個(gè)cDNA樣品重復(fù)3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量報(bào)告進(jìn)行試驗(yàn)體系評(píng)價(jià)和目的基因表達(dá)分析。使用Opticon MonitorTM 1.02軟件(MJ Research)對(duì)BoFLC3基因相對(duì)表達(dá)含量進(jìn)行分析。

1.6 亞細(xì)胞定位分析

利用Gateway技術(shù)，將上一步的PCR回收產(chǎn)物與入門載體pdonr221和表達(dá)載體pEarlyGate101分別進(jìn)行BP和LR重組反應(yīng)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，將有擴(kuò)增產(chǎn)物且片段大小正確的克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證后即獲得重組質(zhì)粒 (亞細(xì)胞定位載體) pEarlyGate101-BoFLC3-YFP。然后，利用液氮凍融法將重組融合表達(dá)載體pEarlyGate101-BoFLC3-YFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。將含有表達(dá)載體pEarlyGate101-BoFLC3-YFP的GV3101農(nóng)桿菌單菌落接種于含卡那霉素的YEB培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min培養(yǎng)20 h。然后加入1%體積的菌液到同樣的YEB培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min培養(yǎng)至菌液OD600為1.0。在4 000 r/min下離心15 min，收集菌體細(xì)胞，用終濃度為10 mmol/L 的MgCl2，10 mmol/L MES (調(diào)節(jié)pH至5.7)，150 μmol/L 乙酰丁香酮的注射緩沖液重懸至OD600為1.0，室溫放置5 h后，用1 ml的無(wú)針頭注射器將含有pEarlyGate101-BoFLC3-YFP的農(nóng)桿菌菌液注射煙草葉片，用H2B-RFP作為細(xì)胞核標(biāo)記。注射后的煙草植株置于25 ℃，16 h/8 h的光/暗周期下培養(yǎng)3 d。在激光共聚焦顯微鏡下觀察YFP熒光信號(hào)及H2B-RFP紅色細(xì)胞核熒光信號(hào)，進(jìn)行BoFLC3蛋白的亞細(xì)胞定位分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)抽薹相關(guān)基因BoFLC3的全長(zhǎng)克隆及拼接

根據(jù)甘藍(lán)BoFLC3基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出甘藍(lán)BoFLC3基因片段。結(jié)果(圖1)表明：該基因全長(zhǎng)為570 bp。

M：DL2000。圖1 甘藍(lán)BoFLC3基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of BoFLC3 gene in cabbage

2.2 甘藍(lán)抽薹相關(guān)基因BoFLC3序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1 甘藍(lán)BoFLC3蛋白的理化性質(zhì)分析 對(duì)BoFLC3基因所編碼氨基酸序列(圖2)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析得到，BoFLC3基因編碼197個(gè)氨基酸，其蛋白質(zhì)分子量為20 990；等電點(diǎn)為9.45，說(shuō)明該蛋白呈堿性；負(fù)電荷氨基酸(Asp+Glu)26個(gè)，正電荷氨基酸(Arg + Lys)34個(gè)；摩爾消光系數(shù)0.219(胱氨酸全按半胱氨酸計(jì))；該蛋白不穩(wěn)定性參數(shù)46.88，屬于不穩(wěn)定蛋白；其脂肪系數(shù)96.93；平均親水性(GRAVY)-0.521；序列N末端為Met，推測(cè)其半衰期在網(wǎng)狀細(xì)胞中為30 h，在酵母中大于20 h，在大腸桿菌中大于10 h。

2.2.2 甘藍(lán)BoFLC3編碼的氨基酸序列同源性及進(jìn)化樹(shù)分析 在NCBI站點(diǎn)上用BLAST分析BoFLC3基因編碼氨基酸序列與其他植物抽薹相關(guān)基因的同源性，結(jié)果(圖3)表明，BoFLC3基因與已克隆的植物的抽薹相關(guān)基因均有不同程度同源性，與不結(jié)球白菜的控制抽薹基因堿基序列相似性高達(dá)94%，與擬南芥(同源蛋白編號(hào)AAV51217) 控制抽薹基因堿基序列相似性為79%。DNAman軟件對(duì)BoFLC3及其他植物抽薹相關(guān)基因的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)樹(shù)分析，結(jié)果(圖4) 顯示，BoFLC3基因與不結(jié)球白菜最先聚為一類，親緣關(guān)系最近，而后與蘿卜聚為一類。與擬南芥(AAV51217)，白芥(ABP96967)親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖2 BoFLC3的核苷酸序列(上列)及其編碼的氨基酸序列(下列)Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequences of BoFLC3

圖3 不同植物BoFLC3基因編碼的氨基酸序列同源性比較Fig.3 Alignment of predicted amino acid sequences of BoFLC3 genes from different plants

圖4 不同植物BoFLC3編碼的氨基酸序列的系統(tǒng)樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the deduced amino acid sequences of BoFLC3 in different species

2.2.3 甘藍(lán)BoFLC3蛋白疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)和分析 蛋白質(zhì)的疏水性分析是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中一個(gè)必要的過(guò)程，通過(guò)分析可以得到蛋白質(zhì)的親疏水區(qū)域，一方面可以為二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果提供參考，另一方面還可以為結(jié)構(gòu)域以及功能域的劃分提供依據(jù)。因此，對(duì)甘藍(lán)BoFLC3氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析，結(jié)果 (圖5) 表明，在該蛋白35～50 aa處有1個(gè)顯著疏水峰，其他區(qū)域以親水性為主?？缒そY(jié)構(gòu)域是膜中蛋白與膜脂結(jié)合的主要部位，一般由20個(gè)左右的疏水氨基酸殘基組成，形成α螺旋，與膜脂相結(jié)合。預(yù)測(cè)和分析跨膜結(jié)構(gòu)域，對(duì)認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、分類以及在細(xì)胞中的作用部位均有一定的意義。利用TMpred在線軟件預(yù)測(cè)甘藍(lán)BoFLC3蛋白的跨膜螺旋區(qū)域，該軟件預(yù)測(cè)得分超過(guò)500的區(qū)域?yàn)榭赡艿目缒ぢ菪齾^(qū)域，符合該條件的區(qū)域?yàn)?5～57 aa處膜外向膜內(nèi)的跨膜螺旋(圖6)，被賦予的分值為942(34～59 aa處膜內(nèi)向膜外的跨膜螺旋，賦予分值為895)。跨膜區(qū)域位于膜結(jié)構(gòu)中，應(yīng)為蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域。上述預(yù)測(cè)的跨膜螺旋與ProtScale預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)疏水區(qū)對(duì)應(yīng)。因此，被預(yù)測(cè)的跨膜螺旋區(qū)可信度較高。

圖5 甘藍(lán)BoFLC3蛋白的疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of BoFLC3 in Brassica oleracea

圖6 甘藍(lán)BoFLC3蛋白的跨膜螺旋區(qū)分析Fig.6 TMpred output for BoFLC3 in Brassica oleracea

2.2.4 甘藍(lán)BoFLC3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析 多肽鏈借助氫鍵排列成沿一維方向呈現(xiàn)有規(guī)則重復(fù)構(gòu)象的二級(jí)結(jié)構(gòu)，是氨基酸順序與三維構(gòu)象之間的橋梁。二級(jí)結(jié)構(gòu)借助范德華力、氫鍵、靜電和疏水等相互作用形成蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮正常的生物學(xué)功能。據(jù)此，用SOPMA對(duì)甘藍(lán)BoFLC3蛋白的氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果 (圖7) 表明，BoFLC3蛋白含有比較豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)，由120個(gè)氨基酸殘基組成α螺旋結(jié)構(gòu)，占全部氨基酸殘基的60.91%；24個(gè)氨基酸殘基組成延伸鏈，占全部氨基酸殘基的12.18%；由10個(gè)氨基酸殘基組成β轉(zhuǎn)角，占全部氨基酸殘基的5.08%；由43個(gè)氨基酸殘基組成隨機(jī)卷曲，占全部氨基酸的21.83%?？梢钥闯觯S機(jī)卷曲和α-螺旋是BoFLC3多肽鏈中的主要結(jié)構(gòu)元件，β轉(zhuǎn)角和延伸鏈散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

圖7 甘藍(lán)BoFLC3蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) Fig.7 The secondary structure of BoFLC3 in Brassica oleracea

2.2.5 甘藍(lán)BoFLC3蛋白的功能域預(yù)測(cè)分析 利用SMART軟件對(duì)甘藍(lán)BoFLC3蛋白進(jìn)行功能域預(yù)測(cè)分析，結(jié)果(圖8)表明，該基因?yàn)镸ADS盒基因，其編碼的蛋白1～60 aa屬于MADS盒基因蛋白，MADS-box基因是一個(gè)序列特異的調(diào)節(jié)基因家族，其編碼的MADS-box蛋白轉(zhuǎn)錄因子以二聚體化的形式通過(guò)保守的MADS結(jié)構(gòu)域與特定的DNA序列結(jié)合來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)，通過(guò)反向平行的α-螺旋二聚體結(jié)構(gòu)與DNA小溝相互作用。MADS-box基因編碼一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是一類調(diào)節(jié)植物發(fā)育的重要基因，在決定植物開(kāi)花時(shí)間和花形態(tài)建成中起著非常重要的作用。

圖8 BoFLC3蛋白的功能域預(yù)測(cè)分析Fig.8 Prediction analysis on functional domains of BoFLC3 protein

2.3 BoFLC3基因在甘藍(lán)不同組織中的特異性表達(dá)

如圖9所示，BoFLC3基因的表達(dá)在甘藍(lán)不同組織中存在顯著的差異，抽薹后，根中表達(dá)量最少，花蕾與花瓣中的表達(dá)量相近且略低于莖部中的表達(dá)量，葉片中表達(dá)量最高。

圖9 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)分析BoFLC3基因在不同組織中的表達(dá)Fig.9 Real-time quantitative PCR analysis of BoFLC3 gene expression in different tissues

2.4 亞細(xì)胞定位分析

將含有pEarlyGate101-BoFLC3-YFP的農(nóng)桿菌侵染煙草植株36 h后，利用熒光共聚焦顯微鏡觀察本氏煙葉片中的熒光。結(jié)果見(jiàn)圖10，在激光共聚焦顯微鏡下，試驗(yàn)組pEarlyGate101-BoFLC3-YFP侵染煙草植株在YFP激發(fā)光下可以檢測(cè)到較為明顯的黃色熒光信號(hào)，紅色熒光信號(hào)表示本氏煙植株細(xì)胞核位置；2張熒光信號(hào)重疊表明BoFLC3定位于細(xì)胞核，這與該基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能以及編碼蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)有關(guān)。

圖10 BoFLC3在本氏煙葉片細(xì)胞中的定位Fig.10 Subcellular localization of BoFLC3 in leaves of Nicotiana benthamiana

3 討 論

以擬南芥為模式作物，對(duì)其不同生態(tài)型和突變體的研究結(jié)果表明，基因FLC可能是春化反應(yīng)的關(guān)鍵基因[6]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LC的表達(dá)水平與植株低溫處理的時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，低溫處理時(shí)間越長(zhǎng)，F(xiàn)LC的表達(dá)越弱，去甲基化也可能對(duì)FLC起負(fù)調(diào)控的作用[5-6]。同時(shí)FLC也存在于自主開(kāi)花途徑中，與其他基因共同作用以調(diào)節(jié)植株開(kāi)花時(shí)間[10]。而FLC的表達(dá)對(duì)開(kāi)花起抑制作用。一系列研究結(jié)果表明，春化的低溫作用導(dǎo)致相關(guān)基因的去甲基化，消除了FLC對(duì)開(kāi)花的抑制作用，從而解除對(duì)赤霉素合成途徑的封鎖最終導(dǎo)致植株在一定時(shí)期開(kāi)花[11]。

本試驗(yàn)利用RT-PCR技術(shù)從甘藍(lán)中克隆了BoFLC3基因，在NCBI站點(diǎn)上用BLAST分析BoFLC3基因編碼的氨基酸序列與其他植物抽薹相關(guān)基因的同源性，結(jié)果表明BoFLC3基因與已克隆的植物的抽薹相關(guān)基因均有不同程度同源性，與不結(jié)球白菜的控制抽薹基因堿基序列相似性高達(dá)94%，與擬南芥(AAV51217)控制抽薹基因堿基序列相似性為79%。利用熒光定量PCR就BoFLC3基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，該基因在甘藍(lán)植物體內(nèi)的表達(dá)有普遍性。低溫處理后不同組織BoFLC3的表達(dá)量從高到低依次為：葉>莖>花蕾>花瓣>根。通過(guò)亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明，BoFLC3蛋白定位在細(xì)胞的細(xì)胞核，這與BoFLC3的轉(zhuǎn)錄因子功能相吻合。

本研究利用PCR方法研究了甘藍(lán)抽薹相關(guān)基因BoFLC3的時(shí)空特異性表達(dá)，通過(guò)亞細(xì)胞定位分析了BoFLC3在細(xì)胞中的表達(dá),為下一步研究甘藍(lán)中其他抽薹功能基因提供了經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)。