馬賢武，王 凱，劉 軒，榮昭強(qiáng)，李曉林，劉玉濤

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院/江蘇省智能化農(nóng)業(yè)裝備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210031)

秸稈的資源化利用是解決中國(guó)秸稈過剩問題的根本途徑[1]。目前中國(guó)主要農(nóng)作物秸稈理論資源量為 1.04×109t，其中水稻秸稈為 2.99×108t；但由于農(nóng)村能源結(jié)構(gòu)的改變和各類替代燃料的應(yīng)用，加上秸稈資源分布零散、體積大、收集運(yùn)輸成本高，以及綜合利用經(jīng)濟(jì)效益差，產(chǎn)業(yè)化程度低等原因，導(dǎo)致秸稈出現(xiàn)了地區(qū)性、季節(jié)性、結(jié)構(gòu)性過剩，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成極大的威脅，因而尋求秸稈的合理利用方式已迫在眉睫。

水稻秸稈主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，其表面覆蓋有蠟質(zhì)層和硅質(zhì)層，使得纖維素難以被降解利用。通過預(yù)處理打破秸稈的復(fù)雜結(jié)構(gòu)是提高其利用有效性的重要手段。預(yù)處理方法主要有物理預(yù)處理、化學(xué)預(yù)處理、生物預(yù)處理以及聯(lián)合預(yù)處理等。物理預(yù)處理能夠減少秸稈的尺寸、增大與反應(yīng)物的接觸面積[2]且不會(huì)產(chǎn)生后續(xù)反應(yīng)的抑制物[3]，有利于乙醇和甲烷產(chǎn)量的提升，但其能耗較高導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)上不可行[4]；化學(xué)預(yù)處理的效率較高，但容易導(dǎo)致半纖維素的損失，抑制物產(chǎn)生和二次污染[3]。因而，能否針對(duì)水稻秸稈的特點(diǎn)，部分破壞其表面結(jié)構(gòu)，從而減少預(yù)處理的能源消耗和降低后續(xù)化學(xué)預(yù)處理堿的用量，值得研究。

前期研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)揉搓預(yù)處理后水稻秸稈的硅質(zhì)層遭到破壞，為后續(xù)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣提供了良好的條件，但其酶解還原糖產(chǎn)量卻沒有得到明顯提升。因而，本試驗(yàn)將利用揉搓后聯(lián)合稀Ca(OH)2溶液對(duì)水稻秸稈進(jìn)行預(yù)處理，研究其對(duì)酶解還原糖產(chǎn)生率及硅質(zhì)去除率、結(jié)晶度和化學(xué)成分的影響，旨在為水稻秸稈高效資源化利用提供一種環(huán)境友好且可大規(guī)模應(yīng)用的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用江蘇省南京市六合區(qū)收獲的水稻秸稈為材料，測(cè)得其總固體質(zhì)量濃度(TS)為90.02%，揮發(fā)性固體質(zhì)量濃度(VS)為76.84%，灰分含量為14.08%。對(duì)照秸稈自然風(fēng)干后剪成 2～3 cm小段備用，揉搓處理秸稈通過機(jī)器處理后獲得。

化學(xué)試劑：試驗(yàn)中的化學(xué)試劑均購(gòu)自上海晶純生化科技股份有限公司，均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

紫外分光光度計(jì)(UV-2008)由尤尼柯上海儀器有限公司生產(chǎn)，X射線衍射儀(X’Pert PRO)由荷蘭帕納科公司生產(chǎn)，傅立葉變換紅外光譜儀(Nicolet iS10型)由賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司生產(chǎn)。

1.3 水稻秸稈的預(yù)處理方法

1.3.1 揉搓預(yù)處理 揉搓預(yù)處理機(jī)的工作原理如圖1所示。水稻秸稈進(jìn)入喂入口后，受到喂入口處錘片的打擊，被打斷、打折的秸稈受到錘片的抓取和氣流的抽吸雙重作用，被帶入揉碎室，進(jìn)入揉碎室內(nèi)的物料受到錘片和齒條的沖擊、揉搓以及揉碎室內(nèi)的流場(chǎng)作用，被逐漸加工成絲段狀，最后推送至拋送口處，被拋出揉搓機(jī)。

圖1 揉搓預(yù)處理機(jī)示意圖Fig.1 Working principle diagram of the rubbing pretreatment

1.3.2 揉搓與稀堿聯(lián)合預(yù)處理 將揉搓過的水稻秸稈采用稀Ca(OH)2溶液處理，設(shè)置Ca(OH)2質(zhì)量濃度、處理時(shí)間和處理溫度3個(gè)試驗(yàn)因素，分別取2%、4%、6%，6 d、7 d、8 d和20 ℃、40 ℃、60 ℃ 3個(gè)水平,進(jìn)行正交試驗(yàn)。將反應(yīng)后的樣品用鹽酸中和至中性，洗凈過濾，保留固體殘?jiān)?，放?05 ℃烘箱中烘干后粉碎，分別用40目、60目、200目標(biāo)準(zhǔn)篩篩選出所需粒度的樣品，密封常溫備用。

1.3.3 稀堿預(yù)處理 根據(jù)正交試驗(yàn)得到的最佳質(zhì)量濃度、時(shí)間及溫度組合條件處理原始秸稈。反應(yīng)后的處理步驟與方法1.3.2相同。

經(jīng)過以上預(yù)處理，得到了原始秸稈、揉搓秸稈、稀堿處理原始秸稈、稀堿處理揉搓秸稈4個(gè)不同的處理樣品，分別記為原始、揉搓、原始+堿、揉搓+堿。

1.4 性能測(cè)試表征及檢測(cè)方法

1.4.1 酶解還原糖的檢測(cè) 精確稱取不同預(yù)處理之后過60目篩的水稻秸稈樣品0.2 g，放入錐形瓶中，并加入20 mg纖維素酶，以pH=4.8 NaAc-HAc緩沖液定容至50 ml，混勻后置50 ℃恒溫水箱中反應(yīng)48 h。本研究選用3，5-二硝基水楊酸法檢測(cè)水稻秸稈酶解后還原糖產(chǎn)量[5]。酶解還原糖產(chǎn)生率=還原糖產(chǎn)量/水稻秸稈的質(zhì)量×100%；酶解還原糖提高率=(處理秸稈酶解還原糖產(chǎn)生率-對(duì)照秸稈酶解還原糖產(chǎn)生率)/對(duì)照秸稈酶解還原糖產(chǎn)生率。

1.4.2 水稻秸稈硅去除率檢測(cè) 硅含量檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[6]、[7]。精確稱取不同預(yù)處理之后過60目篩的水稻秸稈樣品0.1 g，放入50 ml離心管中，加入3 ml質(zhì)量比為50%的NaOH消化液，使用渦旋振蕩器混合均勻，保證消化液充分浸潤(rùn)水稻秸稈，放入立式壓力蒸汽滅菌器中121 ℃消化20 min后，使用定性濾紙過濾并定容至50.0 ml，在20.0 ml試管中依次加入5.4 ml去離子水、400.0 μl樣品溶液、3.0 ml 0.26 mol/L鹽酸和400.0 μl 10%鉬酸銨，均勻混合后靜置5 min，再依次加入還原劑20%酒石酸溶液400.0 μl和400.0 μl 2%抗壞血酸溶液，均勻混合后靜置25 min，紫外分光光度計(jì)預(yù)熱20 min后，在600 nm波長(zhǎng)處比色皿測(cè)定。最后根據(jù)不同質(zhì)量濃度硅標(biāo)準(zhǔn)液吸光度結(jié)果所擬合出來的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各吸光度對(duì)應(yīng)的硅含量。硅去除率=(處理秸稈硅含量-對(duì)照秸稈硅含量)/對(duì)照秸稈硅含量。

1.4.3 X射線衍射光譜分析 取不同預(yù)處理之后的過60目篩水稻秸稈樣品，均勻放入玻片凹槽中壓實(shí)，用X射線衍射儀進(jìn)行掃描。測(cè)試條件：銅靶，λ=0.154 mm，管壓40 KV，電流40 mA，掃描步長(zhǎng)0.02°，掃描范圍 10～45°。纖維素的結(jié)晶度(CrI)一般參照Segal經(jīng)驗(yàn)法[8]計(jì)算：CrI=[(I002-Iam)/I002]。式中：I002表示2θ在22°和23°之間的最大衍射強(qiáng)度；Iam表示2θ在18°和19°之間的最小衍射強(qiáng)度。

1.4.4 FTIR紅外光譜分析 取不同預(yù)處理之后的過200目篩水稻秸稈，加入約為樣品質(zhì)量100倍的KBr(溴化鉀)于研缽中，混合均勻后研磨20 min，放入YB-2壓片機(jī)中制備試樣，再利用傅立葉紅外光譜儀掃描試樣。掃描次數(shù)：16次，掃描區(qū)間：4 000～500 cm-1。根據(jù)所得到的紅外光譜分析不同預(yù)處理后秸稈內(nèi)部官能團(tuán)的變化。

1.4.5 不同處理水稻秸稈的成分分析 不同處理水稻秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量測(cè)定參考美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室的方法[9]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 揉搓與稀堿聯(lián)合預(yù)處理對(duì)水稻秸稈酶解產(chǎn)糖率的影響

2.1.1 稀堿處理揉搓秸稈的最佳工藝條件 以酶解產(chǎn)糖率為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)得出稀堿處理揉搓水稻秸稈的最佳工藝條件。正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果分析如表1所示。

根據(jù)表1中的極差值(R)的大小分析，可知影響酶解產(chǎn)糖率的因素強(qiáng)度從大到小依次為：處理時(shí)間、稀堿質(zhì)量濃度、處理溫度。且根據(jù)表中K值可推導(dǎo)出最佳預(yù)處理?xiàng)l件：即Ca(OH)2質(zhì)量濃度6%、處理溫度60 ℃、處理天數(shù)8 d。為了驗(yàn)證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，在得到的最佳預(yù)處理?xiàng)l件下進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得其酶解產(chǎn)糖率為 33.67%，均高于正交實(shí)驗(yàn)表中的9組數(shù)據(jù)。但發(fā)現(xiàn)正交試驗(yàn)表中第4組[處理溫度40 ℃、Ca(OH)2質(zhì)量濃度6%、處理時(shí)間6 d]，其酶解產(chǎn)糖率為 33.62%，與最佳預(yù)處理?xiàng)l件酶解產(chǎn)糖率無(wú)顯著性差異。從經(jīng)濟(jì)成本和能源消耗角度出發(fā)，第4組所消耗的成本要比最佳組合小的多，故選擇第 4組為最優(yōu)預(yù)處理?xiàng)l件。

表1揉搓秸稈稀堿預(yù)處理酶解產(chǎn)糖率正交試驗(yàn)結(jié)果

Table1Theorthogonaltestresultsofenzymatichydrolysissugaryieldbyrubbing-alkalipretreatment

序號(hào)處理溫度(℃)稀堿質(zhì)量濃度(%)處理時(shí)間(d)酶解產(chǎn)糖率(%)1202630.36 2204730.49 3206831.10 4406633.635402726.91 6404831.68 7604631.07 8606730.57 9602833.07 K191.9590.3495.06 K292.22 93.24 87.97 K394.7195.3095.85 K—130.65 30.11 31.69 K—230.74 31.08 29.32 K—331.57 31.77 31.95 極差(R)0.92 1.66 2.63

2.1.2 不同預(yù)處理對(duì)水稻秸稈酶解產(chǎn)糖率的影響 為了驗(yàn)證稀堿與揉搓聯(lián)合預(yù)處理的有效性，分別測(cè)定了原始秸稈、揉搓秸稈、原始秸稈+堿[處理溫度40 ℃、Ca(OH)2質(zhì)量濃度6%、處理時(shí)間6 d]、揉搓秸稈+堿[處理溫度40 ℃、Ca(OH)2質(zhì)量濃度6%、處理時(shí)間6 d]4種預(yù)處理秸稈酶解還原糖產(chǎn)量，結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，經(jīng)過揉搓預(yù)處理后的水稻秸稈酶解產(chǎn)糖率與原始秸稈間沒有顯著差異(P>0.05)，這與前期的試驗(yàn)結(jié)果一致。經(jīng)過稀堿預(yù)處理后的秸稈酶解產(chǎn)糖率為29.86%，較未處理的原始秸稈提升了61.41%，說明稀堿破壞了水稻秸稈的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，提高了纖維素的降解率。揉搓和稀堿聯(lián)合預(yù)處理的水稻秸稈酶解產(chǎn)糖率得到進(jìn)一步提升，達(dá)到了33.63%，與稀堿處理秸稈及揉搓秸稈的酶解產(chǎn)糖率都有顯著差異(P<0.05)，較原始秸稈提升了81.76%，說明揉搓預(yù)處理能夠加強(qiáng)稀堿預(yù)處理的作用效果。

2.2 不同預(yù)處理對(duì)水稻秸稈硅去除率的影響

分別測(cè)定了4種預(yù)處理情況下水稻秸稈的硅含量，結(jié)果如表3所示。水稻秸稈外表面附有一層硅，不僅是疏水性的，而且堅(jiān)固，能夠有效保護(hù)內(nèi)部的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)。因此打破水稻秸稈的硅保護(hù)層，使得水稻秸稈木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)暴露出來，可以大幅提升水稻秸稈的利用率。通過對(duì)硅去除率的分析，可以初步了解揉搓與稀堿聯(lián)合預(yù)處理的作用機(jī)理。

表2不同預(yù)處理對(duì)水稻秸稈酶解產(chǎn)糖率影響

Table2Effectofdifferentpretreatmentsonyieldofenzymatichydrolyzedreducingsugarofricestraw

處理方式 酶解產(chǎn)糖率(%)酶解還原糖提高率(%)原始秸稈18.50±0.15a0揉搓秸稈19.60±0.30a5.95原始秸稈+堿29.86±1.95b61.41揉搓秸稈+堿33.63±0.74c81.76

同一列數(shù)據(jù)后不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

由表3可以看出，揉搓預(yù)處理可以有效去除水稻秸稈表面的硅質(zhì)層，其硅去除率可達(dá)33.40%，而稀堿對(duì)硅去除率影響不明顯，該結(jié)果可以解釋揉搓與稀堿聯(lián)合預(yù)處理的作用機(jī)理，即揉搓預(yù)處理使水稻秸稈表面的硅質(zhì)保護(hù)層被破壞，從而使稀堿更好地作用于內(nèi)部的木質(zhì)纖維素，提升了木質(zhì)纖維素的利用率。

表3不同預(yù)處理對(duì)水稻秸稈硅去除率的影響

Table3Effectofdifferentpretreatmentsonremovalratioofsiliconofricestraw

處理方式 水稻秸稈硅含量 (%)硅去除率(%)原始秸稈9.96±0.08b0揉搓秸稈6.63±0.13a33.40原始秸稈+堿9.57±0.13b3.92揉搓秸稈+堿6.17±0a38.05

同一列數(shù)據(jù)后不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.3 不同預(yù)處理對(duì)水稻秸稈結(jié)晶度的影響

纖維素是構(gòu)成水稻秸稈木質(zhì)纖維素的主要成分，其具有結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形區(qū)兩相結(jié)構(gòu)。而纖維素的結(jié)晶度是指結(jié)晶區(qū)占纖維素整體的百分比[10]。因此，常用X射線圖譜來分析研究纖維素的結(jié)晶程度。

不同預(yù)處理后的水稻秸稈XRD圖譜和結(jié)晶度如圖2所示。經(jīng)過不同預(yù)處理之后，XRD圖譜中各衍射峰的位置基本沒有改變，只是衍射峰的強(qiáng)度有所差異。相比于原始秸稈和揉搓秸稈，經(jīng)過稀堿處理后的水稻秸稈其衍射峰強(qiáng)度在040和002處都明顯升高，說明稀堿預(yù)處理可以使水稻秸稈結(jié)晶區(qū)的有序性得到提升。根據(jù)結(jié)晶度計(jì)算結(jié)果可以看出，經(jīng)過堿處理的原始秸稈和揉搓秸稈，其結(jié)晶度都得到了有效提升，且4種預(yù)處理方式中，揉搓與堿聯(lián)合預(yù)處理組結(jié)晶度最高，相比于原始秸稈結(jié)晶度由42.47%提升至54.31%。這是由于經(jīng)過揉搓和稀堿聯(lián)合預(yù)處理后，水稻秸稈中位于無(wú)定形區(qū)的木質(zhì)素和半纖維素部分被溶出降解[11]，使纖維素的相對(duì)含量增加，從而提升了水稻秸稈的結(jié)晶度。

圖2 不同預(yù)處理后水稻秸稈的XRD圖Fig.2 X-ray diffraction spectra of rice straw by different pretreatments

2.4 不同預(yù)處理后的水稻秸稈紅外光譜分析及成分分析

秸稈的纖維素和木質(zhì)素含量能夠有效反映預(yù)處理的效果和解釋酶解產(chǎn)糖率高低的原因，因而對(duì)不同預(yù)處理水稻秸稈的成分和FTIR紅外光譜進(jìn)行了分析，結(jié)果如表4和圖3所示。

由表4可知，揉搓預(yù)處理使得水稻秸稈纖維素的相對(duì)含量由29.35%提升到35.46%，而木質(zhì)素相對(duì)含量由23.82%降低到18.38%；加堿預(yù)處理能夠大幅提高纖維素的相對(duì)含量和降低木質(zhì)素的相對(duì)含量，分別提高或降低到42.58%、11.88%；揉搓預(yù)處理能夠加強(qiáng)稀堿的作用效果，水稻秸稈揉搓后聯(lián)合稀堿預(yù)處理的纖維素相對(duì)含量由未揉搓原始秸稈稀堿處理的42.58%提高到47.51%，木質(zhì)素含量略有降低。

圖3為不同預(yù)處理后水稻秸稈的紅外光譜圖，可以看出，不同預(yù)處理的圖譜形狀大致相似，但部分特征峰的吸收強(qiáng)度發(fā)生了變化，這表明，經(jīng)過不同預(yù)處理后，水稻秸稈化學(xué)組分相對(duì)含量發(fā)生了變化。在波數(shù)3 420 cm-1處為羥基(-OH)基團(tuán)伸展振動(dòng)吸收峰，各處理在此波數(shù)下吸收峰強(qiáng)度較原始秸稈明顯減弱，其中揉搓和稀堿聯(lián)合預(yù)處理之后吸收峰強(qiáng)度最弱，這說明經(jīng)過揉搓和稀堿聯(lián)合預(yù)處理后，水稻秸稈中氫鍵斷裂，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素之間的連接被破壞。在1 595 cm-1和1 510 cm-1處為木質(zhì)素收縮振動(dòng)吸收峰[12]，可見揉搓和稀堿聯(lián)合預(yù)處理之后該特征峰相對(duì)吸收強(qiáng)度與其他3組相比明顯減弱，說明木質(zhì)素得到了有效去除，這與表4所得到的結(jié)果相符合。

通過不同預(yù)處理水稻秸稈的光譜和成分分析，可知揉搓和稀堿聯(lián)合預(yù)處理有利于木質(zhì)素相對(duì)含量的降低和纖維素相對(duì)含量的提升，從而有利于酶解還原糖含量的提高。

表4不同預(yù)處理對(duì)水稻秸稈成分的影響

Table4Effectofdifferentpretreatmentsoncompositionofricestraw

處理方式 纖維素含量 (%)半纖維素含量 (%)木質(zhì)素含量 (%)原始秸稈29.3520.7423.82揉搓秸稈35.4623.2018.38原始秸稈+堿42.5822.1111.88揉搓秸稈+堿47.5123.6411.30

圖3 不同預(yù)處理后水稻秸稈的紅外光譜圖Fig.3 Flourier transformation infrared spectroscopy spectra of rice straw by different pretreatments

3 討 論

揉搓和稀堿預(yù)處理具有良好的協(xié)同作用。揉搓和稀堿聯(lián)合預(yù)處理后秸稈酶解產(chǎn)糖率為33.63%，硅去除率達(dá)38.05%，可以明顯提高秸稈的結(jié)晶度，有效破壞木質(zhì)素的束縛作用，是一種適于大規(guī)模應(yīng)用的高效的秸稈預(yù)處理方式。

結(jié)合酶解產(chǎn)糖率和經(jīng)濟(jì)成本等因素考慮，獲得秸稈揉搓后Ca(OH)2處理的最佳工藝參數(shù)為：Ca(OH)2質(zhì)量濃度6%，處理溫度40 ℃，處理天數(shù)6 d。

水稻秸稈經(jīng)過揉搓預(yù)處理之后，其表面硅去除率可達(dá)到30%以上。而稀堿預(yù)處理可以使秸稈中木質(zhì)素和半纖維素分子間酯鍵發(fā)生皂化反應(yīng)，使得纖維素、半纖維素和木質(zhì)素間的交叉連接作用減弱，從而使木質(zhì)纖維原料的孔隙度增加[13]。結(jié)合酶解產(chǎn)糖率結(jié)果來看，只經(jīng)過揉搓預(yù)處理對(duì)水稻秸稈酶解產(chǎn)糖率作用效果不明顯，但可以增強(qiáng)后續(xù)稀堿處理的作用效果，在相同的稀堿處理?xiàng)l件下，經(jīng)過揉搓處理的秸稈相比于原始秸稈，其酶解產(chǎn)糖率得到了有效的提升。從X射線衍射光譜、FTIR光譜和秸稈成分測(cè)定結(jié)果來看，水稻秸稈經(jīng)過揉搓和稀堿預(yù)處理后木質(zhì)素得到明顯去除，纖維素的相對(duì)含量得到了進(jìn)一步提升，前人研究發(fā)現(xiàn)，纖維原料中的木質(zhì)素對(duì)纖維素酶與底物的接觸形成立體阻礙，同時(shí)還能夠非特異性吸附纖維素酶[14-15]，而揉搓與稀堿聯(lián)合預(yù)處理，能有效去除秸稈表面硅質(zhì)和內(nèi)部的木質(zhì)素，使纖維素酶更好地作用于纖維素，從而提高了水稻秸稈木質(zhì)纖維素的利用率。揉搓與稀堿聯(lián)合處理的協(xié)同作用效果，與唐洪濤等[16]發(fā)現(xiàn)的較低劑量γ射線輻照(0～200 kGy) 可以大幅降低后續(xù)堿浸泡處理所需的用量和時(shí)間有一定的相似性，但相比于γ射線輻照和稀堿結(jié)合處理以及張婷[17]所采用的超聲波和稀堿聯(lián)合預(yù)處理手段，揉搓與稀堿聯(lián)合預(yù)處理的處理?xiàng)l件比較溫和，所需的經(jīng)濟(jì)成本也更少，可以作為水稻秸稈大規(guī)模高效資源化利用的方式。

本試驗(yàn)采用Ca(OH)2作為代表性堿，缺乏揉搓與其他堿協(xié)同作用效果的比較研究，另外如何有效地將試驗(yàn)廢液中的Ca2+回收利用，有待于進(jìn)一步研究。