秦 臻，韋正新，宰青青，許鍵煒，2

(貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1. 藥理學(xué)教研室、2. 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心，貴州 貴陽 550025)

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一類可替代修復(fù)損傷血管內(nèi)皮，促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)重建的內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞，利用體外擴(kuò)增的EPCs治療缺血性心血管疾病具有較好的應(yīng)用前景[1-2]。然而，EPCs在體外傳代培養(yǎng)中常因老化而難以維持增殖，如何干預(yù)EPCs的衰老，提高EPCs的數(shù)量和質(zhì)量，是臨床治療缺血性心血管疾病急需解決的一個(gè)難點(diǎn)。前期研究表明，黃精可通過提高端粒酶活性來保護(hù)衰老大鼠骨髓EPCs的功能[3]，在此基礎(chǔ)上，本文將進(jìn)一步探討黃精在老年大鼠骨髓EPCs體外傳代培養(yǎng)衰老進(jìn)程中，對細(xì)胞功能及活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康SPF級20月齡SD大鼠20只，體質(zhì)量(520～580) g；3月齡SD大鼠40只，體質(zhì)量(220～260) g，♀♂各半。全部動物由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號：11400700111130。動物飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22～25) ℃，濕度50%～60%，光照12 h，采用標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料和滅菌飲用水喂養(yǎng)。本動物實(shí)驗(yàn)方案獲得貴州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2藥物與試劑 黃精(批號：20150525)購自貴州百靈藥業(yè)；M199培養(yǎng)液(批號：NAA1326)購自Hyclone公司；胎牛血清(批號：A15112-0279)購自PAA公司；大鼠淋巴細(xì)胞分離液(批號：TBD 2013LR)購自天津?yàn)笊锟萍加邢薰荆谎軆?nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF，批號：011210)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，批號：081308)購自PeproTech公司；Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil labeled acetyl low density lipoprotein，Dil-ac-LDL，批號：YB-0013)購自廣州奕源生物科技有限公司；FITC標(biāo)記的荊豆凝集素1(FITC-labeled Ulex europarus agglutinin-1，F(xiàn)ITC-UEA-1，批號：055M4077V)購自Sigma公司；β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自Biovision公司；體外成血管試劑盒購自Millipore公司；ROS檢測試劑盒購自碧云天公司。

1.1.3儀器 TS100倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；IX71熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)。

1.2方法

1.2.1黃精含藥血清的制備 黃精產(chǎn)自貴州，經(jīng)貴陽市藥檢所鑒定為道地藥材，按《中國藥典》(2005)制備黃精水煎液，水浴濃縮備用。將3月齡SD大鼠隨機(jī)分為對照組、黃精高、中、低劑量組，每組10只。灌胃藥量按人與動物體表面積換算，即低劑量組為臨床等效劑量2 g·kg-1，中劑量為5倍臨床等效劑量即10 g·kg-1，高劑量為10倍臨床等效劑量即20 g·kg-1，對照組灌服生理鹽水。每天灌胃2次，連續(xù)3 d，d 4早上1次性灌服全天劑量后采血，離心取上清，過濾除菌。

1.2.2大鼠骨髓EPCs的培養(yǎng)鑒定及細(xì)胞分組 將20月齡健康SD大鼠麻醉處死后，無菌取出雙側(cè)脛骨、股骨，采用密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗滌2次，用M199全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為0.2的胎牛血清，10 mg·L-1的VEGF和bFGF)重懸后，接種于24孔板中，每隔3 d換液1次，收集培養(yǎng)第2代的細(xì)胞，與Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1共同孵育，采用雙染色法鑒定EPCs。將培養(yǎng)第2代的細(xì)胞同步化24 h后，隨機(jī)分為4組：對照組加入空白血清，黃精各劑量組加入黃精高、中、低劑量含藥血清，使各組血清的體積分?jǐn)?shù)為0.1，每隔3 d換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)至第4、6、8代，分別檢測以下指標(biāo)。

1.2.3細(xì)胞衰老程度檢測 按β-半乳糖苷酶染色試劑盒操作說明，PBS洗滌細(xì)胞1次，加入1 mL固定液，室溫固定15 min；PBS洗滌細(xì)胞3次，每次3 min，加入1 mL預(yù)熱的染色工作液，37 ℃無CO2條件下孵育，直到細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色，用封口膜封住孔板防止液體蒸發(fā)，除去染色工作液，加入2 mL PBS緩沖液洗滌，熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(×200)，每個(gè)視野至少100個(gè)細(xì)胞，胞質(zhì)染色者為衰老細(xì)胞，計(jì)算衰老細(xì)胞占觀察細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.2.4細(xì)胞增殖功能檢測 將等量EPCs接種在96孔培養(yǎng)板中，貼壁24 h后，每孔加5 g·L-1的MTT 15 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，再加入DMSO，于微量震蕩器充分震蕩10 min后，置酶標(biāo)儀，于波長570 nm處測吸光值。

1.2.5細(xì)胞遷移功能檢測 消化收集貼壁細(xì)胞，將等量EPCs加入Transwell小室的上室，下室加入含50 mg·L-1VEGF的M199培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，擦去上室中的細(xì)胞，多聚甲醛固定，吉姆薩染色，鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(×200)，計(jì)數(shù)遷移至下層的細(xì)胞，取其平均數(shù)。

1.2.6細(xì)胞成血管功能檢測[4]EPCs成血管功能與增殖、黏附及遷移功能密切相關(guān)，按體外血管生成試劑盒操作說明，將ECMatfixTM膠液和ECM 10×稀釋液置于4 ℃冰箱過夜凍融，每900 μL ECMatfixTM膠液加入ECM 10×稀釋液100 μL，將混勻液加入96孔板，每孔50 μL，孵育1 h凝固成膠；將各處理組細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于膠上；37 ℃培養(yǎng)24 h后，鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(×200)，計(jì)數(shù)長度為寬度的4倍以上的細(xì)胞，取其平均數(shù)。

1.2.7細(xì)胞ROS水平的檢測 按ROS檢測試劑盒操作說明，胰酶消化收集各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，每管加入1 ∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋的2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH)，使每管終體積為100 μL，37 ℃孵育20 min，PBS洗滌2次，上流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1大鼠EPCs的分離培養(yǎng)及鑒定剛分離的大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞呈圓形，傳代培養(yǎng)至第2代時(shí)細(xì)胞呈典型的鋪路石樣，貼壁細(xì)胞經(jīng)FITC-UEA-1和Dil-ac-LDL處理后，熒光顯微鏡下同時(shí)結(jié)合FITC-UEA-1和攝取Dil-ac-LDL的細(xì)胞為正在分化的EPCs(Fig 1)。

Fig 1 Identification of EPCs(×200)

A: Adherent cells with Dil-ac-LDL are red; B: Cells binding FITC-UEA-1 are green; C: Double positive cells are differentiating EPCs

2.2黃精對EPCs衰老程度的影響β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞即為衰老細(xì)胞，F(xiàn)ig 2結(jié)果顯示，隨細(xì)胞傳代次數(shù)增多，細(xì)胞染色陽性率明顯上升(P<0.01)，經(jīng)黃精各劑量干預(yù)后，細(xì)胞在傳代培養(yǎng)中染色陽性率明顯下降(P<0.05)。

Fig 2 Effect of RP on positive rate of β-gal in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vs4th passage in control group

2.3黃精對EPCs增殖功能的影響如Fig 3所示，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增多，細(xì)胞增殖功能明顯降低(P<0.01)，經(jīng)黃精各劑量干預(yù)后，細(xì)胞增殖功能明顯增強(qiáng)(P<0.01)。

Fig 3 Effect of RP on proliferation in

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs4th passage in control group

2.4黃精對EPCs遷移功能的影響如Fig 4所示，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增多，遷移細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.01)，經(jīng)黃精各劑量干預(yù)后，遷移細(xì)胞數(shù)量明顯上升(P<0.01)。

Fig 4 Effect of RP on migration in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vs4th passage in control group

2.5黃精對EPCs成血管功能的影響如Fig 5所示，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增多，成小管細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.01)，經(jīng)黃精高、中劑量干預(yù)后，成小管細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P<0.01)，黃精低劑量僅能增強(qiáng)第4代的細(xì)胞成血管功能，對第6、8代細(xì)胞成血管功能無明顯影響。

Fig 5 Effect of RP on tubule formation in

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs4th passage in control group

2.6黃精對細(xì)胞ROS水平的影響流式細(xì)胞儀檢測到的DCFH熒光強(qiáng)度可反映細(xì)胞ROS的水平，且呈正相關(guān)。Fig 6結(jié)果表明，隨細(xì)胞傳代次數(shù)增多，其ROS水平迅速上升(P<0.01)，經(jīng)黃精各劑量干預(yù)后，細(xì)胞ROS水平明顯降低(P<0.01)。

3 討論

EPCs是一類具有巨大增殖潛力的內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞，在血管損傷、缺血缺氧等條件下，EPCs不僅可向損傷血管遷移募集，參與受損內(nèi)皮的修復(fù)及血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，還能分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)血管的修復(fù)重建。因此，由EPCs介導(dǎo)的缺血性心血管疾病的治療已成為目前再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[1-2,5]。

Fig 6 Effect of RP on level of ROS in

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vs4th passage in control group

然而，EPCs會隨機(jī)體衰老出現(xiàn)老化跡象，這主要由年齡、遺傳、端粒酶等決定[3, 6]。同時(shí)，EPCs在體外培養(yǎng)過程中也會出現(xiàn)復(fù)制時(shí)間延長，甚至停滯等老化跡象，這可能是因?yàn)榧?xì)胞在短期內(nèi)不斷復(fù)制，又無體內(nèi)環(huán)境的保護(hù)，多種外界局部因素對細(xì)胞的各種有害刺激逐漸積累所致。本研究也表明，取自老年大鼠骨髓的EPCs在體外傳代培養(yǎng)過程中迅速衰老，并伴有細(xì)胞功能的明顯衰退。

衰老自由基學(xué)說認(rèn)為，衰老過程是機(jī)體組織細(xì)胞不斷產(chǎn)生自由基積累的結(jié)果?；钚匝躅愂羌?xì)胞氧化系統(tǒng)產(chǎn)生的含有ROS功能基團(tuán)的化合物，也是體內(nèi)最重要的自由基。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于平衡，但在細(xì)胞衰老進(jìn)程或刺激因子存在時(shí)，其胞內(nèi)清除ROS的調(diào)節(jié)機(jī)制失衡，積累增多的ROS又會損害細(xì)胞功能，加速細(xì)胞衰老[7-8]?？梢姡琑OS的異常增多是加速EPCs衰老的一個(gè)關(guān)鍵因素。本研究也表明，EPCs在體外傳代培養(yǎng)老化進(jìn)程中伴有ROS異常迅速增多，而增多的ROS又可繼續(xù)加重EPCs老化，并損傷EPCs功能。

黃精是療效確切的抗衰老中藥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究已表明，黃精及其主要成分黃精多糖可增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能，有效清除自由基，減輕炎癥損傷反應(yīng)；可有效提高EPCs的端粒酶活性，延緩在體EPCs的衰老[3, 9-10]。本研究進(jìn)一步表明，黃精可有效干預(yù)老年大鼠EPCs的體外傳代培養(yǎng)老化進(jìn)程，其機(jī)制可能是通過降低細(xì)胞ROS水平，減輕細(xì)胞氧化損傷來保護(hù)衰老進(jìn)程中EPCs功能。由于線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場所，也是ROS作用最敏感的部位，線粒體功能損傷是ROS異常增多最主要的原因之一，與細(xì)胞衰老關(guān)系密切，黃精是否可以通過維護(hù)線粒體功能來達(dá)到抗EPCs衰老的機(jī)制，尚待后續(xù)研究。