盛杰霞，鄧 旭，包 軍，王志美，代二慶，鄧全軍

(1. 錦州醫(yī)科大學中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，天津 300162；中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫(yī)院2. 軍人醫(yī)療保健中心、3. 消化內(nèi)科，天津 300162)

食管癌是中國主要的公共衛(wèi)生問題，是全球第八大常見癌癥，也是癌癥死亡的第六大常見原因[1]，具有起病隱匿、進展迅速、治愈率差等特點[2]。早期手術切除是食管癌主要的治療手段，大部分患者確診時已進展至晚期，經(jīng)常伴隨全身多處轉(zhuǎn)移，已錯失最佳手術機會，因此，尋找有效防治食管癌侵襲和轉(zhuǎn)移的藥物刻不容緩。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，許多傳統(tǒng)中藥的有效成分均有明顯的抗腫瘤活性。中藥蟾酥是中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍耳后及皮膚分泌物經(jīng)加工干燥而成，具有止痛、強心、抗菌、局部麻醉和抗腫瘤作用。華蟾酥毒基是來自蟾蜍皮膚的主要活性化合物，現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，華蟾酥毒基具有抗乳腺癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和肝癌的抗腫瘤活性[3-4]，但是它在食管癌中的抗腫瘤機制少見報道。PI3K/Akt信號通路失衡是介導食管癌細胞發(fā)生侵襲遷移的重要分子機制[5]，通過激活Akt調(diào)節(jié)下游信號分子，影響腫瘤細胞運動性和血管生成，局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)在這一過程中起調(diào)控作用[6]。因此，本研究以人食管鱗癌細胞株Kyse-520為研究對象，觀察華蟾酥毒基對食管癌細胞體外增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，并探討其作用機制是否與FAK/PI3K/Akt通路有關。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞與試劑 人食管鱗癌細胞株Kyse-520購自中國科學院細胞庫。華蟾酥毒基(批號3070，質(zhì)量分數(shù) ≥ 98%)購自上海詩丹得生物技術有限公司；CCK-8試劑盒(上海東仁化學科技有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Mixture(康為世紀生物科技有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco)；Matrigel膠、Transwell小室(Corning公司)；總RNA提取試劑RNAiso Plus(北京寶日醫(yī)生物技術有限公司)；ECL化學發(fā)光試劑(美國伯樂公司)；BCA蛋白定量試劑盒(索萊寶生物技術有限公司)；FAK、PTEN兔抗人多克隆抗體、β-actin鼠抗人單克隆抗體、HRP標記的二抗(美國Proteintech公司)；p-FAK(Tyr397)、Akt、p-Akt(Ser473)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9, MMP-9)、MMP-2兔抗人單克隆抗體(Abcam公司)。

1.1.2儀器 JuLITMStage實時細胞記錄儀(韓國NanoEnTek公司)；超微量分光光度計NP80(德國IMPLEN公司)；PCR TCR0096(美國Thermo公司)；M2型全波長酶標儀(美國MD公司)；Power Pac Basic電泳儀、ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)。

1.2方法

1.2.1CCK-8法檢測細胞增殖活性 Kyse-520細胞按常規(guī)方法消化傳代，并置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育。經(jīng)預實驗證實，含0.1%溶媒(DMSO)的培養(yǎng)液對細胞生長無明顯影響。在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種對數(shù)生長期的細胞懸液100 μL，設立對照組、藥物組和僅含培養(yǎng)基的空白組，每組設5個復孔并孵育過夜。然后，空白組和對照組每孔補充新鮮的完全培養(yǎng)基100 μL，藥物組每孔加入100 μL含有不同濃度華蟾酥毒基(0.025、0.1、0.4、1.6、6.4 μmol·L-1)的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中分別孵育12、24、48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h后，酶標儀測定450 nm處吸光度(A)值。按照公式計算細胞增殖率，細胞增殖率=(A藥物組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。利用直線回歸方程計算華蟾酥毒基不同作用時間的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。實驗獨立重復3次。

1.2.2劃痕愈合實驗檢測細胞運動性 Kyse-520細胞分別設立對照組和華蟾酥毒基(25、50、100 μmol·L-1)組，將密度為1×105·L-1的細胞均勻鋪于6孔板中，培養(yǎng)箱中孵育16～24 h使其形成單層細胞。含1% FBS的培養(yǎng)基饑餓12 h后，用10 μL槍頭在單層細胞中間劃3條平行直線。PBS洗凈劃傷細胞，按實驗分組加入含不同藥物濃度的完全培養(yǎng)基，每孔選取5個固定位點進行實時監(jiān)測，實時細胞記錄儀置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中，設置6 h為1個循環(huán)，監(jiān)測9個循環(huán)后，利用JuLITMStage系統(tǒng)軟件進行開放傷口面積測量和百分比計算[7]。

1.2.3Transwell小室法檢測細胞侵襲遷移能力 對數(shù)生長期的Kyse-520細胞，用含1% FBS的培養(yǎng)基饑餓12 h，然后加入含有不同濃度華蟾酥毒基(0、25、50、100 nmol·L-1)的完全培養(yǎng)基干預24 h。在Transwell遷移實驗中，將孔徑為8.0 μm的Transwell小室置于24孔板中。常規(guī)消化各組細胞，用無血清培養(yǎng)基制備細胞懸浮液，并以5×104/孔的細胞密度接種在Transwell上室中，同時在下室中加入600 μL含15% FBS的完全培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)24 h后，用鑷子取出Transwell小室，PBS洗滌3次，100%甲醇室溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，然后用濕棉簽擦去濾膜上表面的未遷移細胞。在顯微鏡下，隨機選取5個視野計數(shù)，計算遷移細胞數(shù)目的平均值，并進行統(tǒng)計學分析。

在侵襲實驗中，Transwell小室上底面需要均勻涂覆60 μL用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基1 ∶4稀釋后的基質(zhì)膠，置于培養(yǎng)箱中凝固1 h。其余步驟與Transwell遷移實驗一致。所有實驗獨立重復3次。

1.2.4RT-qPCR檢測基因mRNA表達水平 將Kyse-520細胞以5×105·L-1密度接種在6孔培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h。然后分別加入2 mL含有不同濃度華蟾酥毒基(0、25、50、100 nmol·L-1)的完全培養(yǎng)基干預24 h。收集各組細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，應用超微量分光光度計NP80測定RNA純度及濃度[8]。引物由上海生工生物工程有限公司設計合成(Tab 1)。按實驗說明書進行cDNA合成，采用20 μL體系進行PCR擴增：2 μL cDNA，10 μL 2×UltraSYBR Mixture，6.8 μL RNase ddH2O和0.6 μL兩種特異性引物(10 μmol·L-1)；反應條件：95 ℃ 10 min預變性，95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min，進行40個PCR循環(huán)。反應結(jié)束時進行熔解曲線分析，以評估擴增的特異性。每個cDNA樣本設置3個復孔，實驗結(jié)果采用2-ΔΔCt進行相對定量，與對照組相比的倍數(shù)變化作為mRNA相對表達量。所有實驗獨立重復3次。

Tab 1 Primers used for RT-qPCR

1.2.5Western blot檢測蛋白表達水平 融合度達80%的Kyse-520細胞用含不同濃度華蟾酥毒基(0、25、50、100 nmol·L-1)的完全培養(yǎng)基干預24 h。加入200 μL RIPA裂解液與1×酶抑制劑的混合液，冰上裂解30 min后，收集上清液。BCA法測定蛋白濃度，40 μg總蛋白加入12% SDS-PAGE凝膠中電泳分離。采用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉或5% BSA室溫封閉1 h，分別加入1 ∶1 000～1 ∶2 000稀釋的FAK、p-FAK，Akt、p-Akt、PTEN、VEGF-A、MMP-2、MMP-9和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次后，加入相應HRP標記的二抗(1 ∶10 000稀釋)，室溫孵育1 h。在成像系統(tǒng)上化學發(fā)光并對條帶進行灰度值分析，β-actin作為內(nèi)參，目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值作為蛋白相對表達量。所有實驗獨立重復3次。

2 結(jié)果

2.1華蟾酥毒基抑制食管癌Kyse-520細胞增殖活性Fig 1的CCK-8結(jié)果顯示，華蟾酥毒基以時間和濃度依賴的方式抑制食管癌細胞的增殖(P<0.05)，其作用Kyse-520細胞12、24、48 h的IC50值分別是6.002、0.625、0.079 μmol·L-1。同時發(fā)現(xiàn)，同一作用時間下，華蟾酥毒基濃度低于0.1 μmol·L-1時細胞增殖活性下降較少，因此，選取25、50、100 nmol·L-1的華蟾酥毒基進行后續(xù)實驗，以探討其對Kyse-520細胞侵襲遷移能力的影響[9]。

2.2華蟾酥毒基抑制食管癌Kyse-520細胞的遷移癌細胞的遷移能力與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關[9]。劃痕愈合實驗結(jié)果表明(Tab 2、Fig 2)，無論是6 h，還是48 h，各濃度華蟾酥毒基均能明顯縮小劃痕愈合面積(P<0.01)，且隨著時間的延長和藥物濃度的增加，“傷口”逐漸增大，提示華蟾酥毒基抑制食管癌細胞的“二維”平面遷移，且該效應呈濃度和時間依賴性。不同濃度華蟾酥毒基干預24 h后，Transwell遷移實驗結(jié)果顯示(Fig 3)，隨著藥物濃度的增加，Kyse-520細胞穿膜細胞數(shù)明顯減少(P<0.01)，提示華蟾酥毒基可明顯抑制食管癌細胞的“三維”平面遷移，且存在明顯的量效關系。

Fig 1 Effect of cinobufagin onproliferation of Kyse-520

*P<0.05vs12 h group at same concentration;#P<0.05vs24 h group at same concentration

2.3華蟾酥毒基抑制食管癌Kyse-520細胞的侵襲Matrigel基質(zhì)膠可以一定程度上模擬癌細胞在體內(nèi)侵襲環(huán)境中的細胞外基質(zhì)[10]，Transwell侵襲實驗可以用來評估華蟾酥毒基對Kyse-520細胞侵襲能力的影響。Fig 3結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)25、50、100 nmol·L-1的華蟾酥毒基處理24 h后，Kyse-520的穿膜細胞數(shù)明顯減少(P<0.05，P<0.01)，且呈濃度依賴的方式，提示華蟾酥毒基可明顯抑制食管癌細胞的侵襲能力。

2.4華蟾酥毒基對食管癌Kyse-520細胞中FAK/PI3K/Akt信號通路和侵襲轉(zhuǎn)移相關蛋白mRNA表達的影響Tab 3的RT-qPCR結(jié)果顯示，當華蟾酥毒基的濃度為50、100 nmol·L-1時，VEGF-A、MMP-2、MMP-9 mRNA表達明顯下調(diào)，PTEN mRNA表達明顯上調(diào)，與對照組相比差異有顯著性(P<0.01)，且呈一定的濃度依賴性，而FAK、Akt mRNA表達改變不明顯。

Tab 2 Effect of cinobufagin on migration of Kyse-520 cells detected by wound healing

**P<0.01vscontrol group at the same time

Fig 2 Effect of cinobufagin on migration of Kyse-520 cells(×40)

Fig3EffectofcinobufaginoninvasionandmigrationofKyse-520cells

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Tab 3 Effect of cinobufagin on mRNA expression levels of FAK, Akt, PTEN, MMP-2, MMP-9 and VEGF-A in Kyse-520

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 4 Effect of cinobufagin on expression levels of relative proteins in Kyse-520 vs control group

2.5華蟾酥毒基對食管癌Kyse-520細胞中FAK/PI3K/Akt信號通路和侵襲轉(zhuǎn)移相關蛋白表達的影響如Fig 4所示，當華蟾酥毒基的濃度為50、100 nmol·L-1時，與對照組相比，VEGF-A、MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯減少(P<0.05，P<0.01)，PTEN蛋白表達明顯上升(P<0.05)，F(xiàn)AK和Akt總蛋白表達無明顯變化。由于FAK/PI3K/Akt信號通路主要是通過磷酸化發(fā)揮作用[6]，因此，Western blot檢測了p-FAK(Tyr397)、p-Akt(Ser473)的表達，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加，二者磷酸化水平均明顯下調(diào)(P<0.05，P<0.01)，提示華蟾酥毒基可明顯抑制FAK/PI3K/Akt信號通路。

3 討論

食管癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，進展迅速，并且經(jīng)常伴隨淋巴結(jié)和遠端器官的轉(zhuǎn)移。侵襲和轉(zhuǎn)移是癌細胞最具代表性的生物學特性，它的發(fā)生包括多個復雜的過程，涉及眾多信號通路，并且受到轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、微環(huán)境等影響[11]。靶向抑制誘導癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的信號途徑作為治療腫瘤的一個新的策略已被廣大學者認同，這也可能是很多天然藥物阻止或切斷食管癌轉(zhuǎn)移進程的作用機制。臨床資料顯示，華蟾酥注射液、片劑、膠囊等制劑針對惡性腫瘤的治療取得很好療效。大量實驗室研究表明，其主要活性成分華蟾酥毒基的抗腫瘤機制可總結(jié)為抑制細胞增殖，誘導分化，促進凋亡，引起周期阻滯，抑制腫瘤血管生成，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥和調(diào)節(jié)免疫反應等[12]。同時體內(nèi)外實驗表明，華蟾酥毒基可以抑制結(jié)腸癌、骨肉瘤等惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[3,13]。本研究也發(fā)現(xiàn)，華蟾酥毒基體外可明顯抑制人食管癌Kyse-520細胞的增殖，即使是對細胞增殖活性影響較弱的濃度也可明顯縮小劃痕愈合面積，減少遷移和侵襲穿膜細胞數(shù)，提示其對食管癌細胞的遷移和轉(zhuǎn)移具有明顯抑制作用。

大量研究已經(jīng)證實，抑制PI3K/Akt通路可以降低腫瘤細胞的侵襲遷移能力[14]。PI3K是由110 ku催化亞基和85 ku調(diào)節(jié)亞基組成的異二聚體酶，活化的PI3K磷酸化PIP2以產(chǎn)生PIP3，隨后，PIP3積累并將Akt/PKB和PDK1募集到細胞膜上，被激活的Akt會使大量下游底物磷酸化，進而調(diào)控細胞遷移、周期進程、存活和代謝[15]。FAK是一種細胞質(zhì)酪氨酸激酶，高水平的FAK誘導轉(zhuǎn)移，并且與食管癌的不良預后相關。本研究采用RT-qPCR和Western blot檢測華蟾酥毒基處理的Kyse-520細胞中FAK和Akt的表達水平，結(jié)果顯示，F(xiàn)AK和Akt總蛋白及mRNA表達無明顯變化，進一步檢測其磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)華蟾酥毒基可明顯下調(diào)p-FAK(Tyr397)和p-Akt(Ser473)。眾所周知，基質(zhì)金屬蛋白酶可以降解基底膜和細胞外基質(zhì)，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關鍵性作用，MMP-2和MMP-9是其中最重要的一類。VEGF家族直接或間接地與腫瘤轉(zhuǎn)移有關，而VEGF-A可以激活靜息血管內(nèi)皮細胞，誘發(fā)血管生成并促進腫瘤細胞遷移。有研究證實，F(xiàn)AK通過激活PI3K/Akt通路，調(diào)節(jié)VEGF-A、MMP-2和MMP-9的活性，促進血管生成、細胞遷移和侵襲[8]。本研究也發(fā)現(xiàn)，華蟾酥毒基濃度依賴性地降低VEGF-A、MMP-2和MMP-9的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。上述結(jié)果提示，華蟾酥毒基通過FAK/PI3K/Akt信號通路，下調(diào)VEGF-A、MMP-2和MMP-9的表達，進而抑制食管癌的遷移和侵襲。

PTEN是一種雙重脂質(zhì)蛋白磷酸酶，是FAK/PI3K/Akt信號通路負調(diào)控因子。正常情況下，PTEN與PI3K的功能相反，可以通過去磷酸化將PIP3轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP2；同時，PTEN還具有特異性蛋白磷酸酶功能，通過下調(diào)FAK酪氨酸磷酸化，抑制整合素介導的細胞浸潤、轉(zhuǎn)移及生長，進而抑制癌細胞遷移擴散和黏附[10]。在鼠胚胎干細胞或人癌細胞系中，PTEN功能的喪失導致PIP3的積累，模擬PI3K激活的作用，并激活其下游效應物PDK1、Akt和Rac1/CDC42[15]。本研究也顯示，華蟾酥毒基在削弱FAK磷酸化和抑制PI3K/Akt活化的同時，明顯增加Kyse-520細胞中PTEN的表達。

綜上所述，華蟾酥毒基通過誘導PTEN表達，負調(diào)控FAK/PI3K/Akt途徑，下調(diào)VEGF-A、MMP-2和MMP-9的表達，進而抑制食管癌細胞的遷移和侵襲。

(致謝：本實驗在武警后勤學院附屬醫(yī)院救援醫(yī)學研究所完成，感謝課題組老師同學們的協(xié)助。)