張俊仙 吳雪瓊

耐藥結(jié)核病，尤其是耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)的診斷和治療是當(dāng)前結(jié)核病防控面臨的重大難題。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，結(jié)核分枝桿菌(MTB)耐藥分子機(jī)制逐步被闡明，建立于MTB耐藥相關(guān)靶基因突變檢測(cè)基礎(chǔ)上的分子藥物敏感性檢測(cè)(drug susceptibility test，DST)試劑盒也逐步問世，目前已能夠?yàn)榕R床檢測(cè)下列靶基因突變：利福平(RFP)耐藥相關(guān)基因rpoB，異煙肼(INH)耐藥相關(guān)基因katG和inhA，鏈霉素(Sm)耐藥相關(guān)基因rpsl和rrs，乙胺丁醇(EMB)耐藥相關(guān)基因embB，氟喹諾酮類(FQ)藥物耐藥相關(guān)基因gyrA和gyrB，二線注射類抗結(jié)核藥物耐藥相關(guān)基因rrs，吡嗪酰胺(PZA)耐藥相關(guān)基因pncA。筆者對(duì)MTB的DST產(chǎn)品及新方法的研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

一、獲得我國注冊(cè)證書的試劑盒

截至目前，經(jīng)我國國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)的國內(nèi)外DST試劑有16個(gè)，其中進(jìn)口試劑有5個(gè)，用于表型DST的有3個(gè)(BACTEC MGIT 960 系統(tǒng)、Bact/ALERT 3D和分枝桿菌藥物敏感性檢測(cè)板Sensititre?MYCOTB)，用于分子DST的有2個(gè)(GeneXpert MTB/RIF和GenoType MTBDRplus)；國產(chǎn)試劑有11個(gè)，用于表型DST的有2個(gè)[分枝桿菌藥物敏感性檢測(cè)試劑盒(培養(yǎng)法)和MTB藥物敏感性試劑盒)，用于分子DST的有9個(gè)(包括DNA微陣列芯片法、PCR-線性探針雜交法、熒光PCR熔解曲線法和PCR-基因測(cè)序法等)，用于檢測(cè)RFP、INH、Sm、EMB和FQ等耐藥性。

(一)表型DST方法

1. BACTEC MGIT 960系統(tǒng)：于1997年由美國推出的集分枝桿菌快速生長(zhǎng)培養(yǎng)、檢測(cè)及DST技術(shù)為一體的全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀。該儀器采用熒光法的原理，在培養(yǎng)管底部包埋有熒光顯示劑，直接感應(yīng)培養(yǎng)管內(nèi)氧氣濃度。當(dāng)培養(yǎng)管內(nèi)有分枝桿菌生長(zhǎng)時(shí)，氧氣被消耗，熒光顯示劑在二極管的激發(fā)下發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度記憶探測(cè)器每隔60 min連續(xù)測(cè)定培養(yǎng)管內(nèi)熒光強(qiáng)度，并通過數(shù)據(jù)處理得出陽性結(jié)果。陽性培養(yǎng)管取出后離心，沉淀物進(jìn)行涂片抗酸染色以確定是否為分枝桿菌。涂片陽性管進(jìn)一步進(jìn)行表型液體DST比例法：每株MTB準(zhǔn)備5支MGIT 960培養(yǎng)管，1管為生長(zhǎng)對(duì)照管，加1∶100無菌生理鹽水稀釋的菌懸液0.5 ml；4管為加藥管，分別加入RFP、INH、Sm和EMB及菌懸液。放入BACTEC MGIT 960儀器，在4～13 d內(nèi)根據(jù)生長(zhǎng)指數(shù)自動(dòng)報(bào)告耐藥或敏感結(jié)果。國內(nèi)研究顯示，BACTEC MGIT 960檢測(cè)與改良羅氏(L-J)培養(yǎng)基比例法比較，檢測(cè)RFP、INH、Sm和EMB的耐藥結(jié)果符合率分別為91.62%～98.78%、97.55%～97.77%、93.86%～96.73%和94.97%～96.73%，具有很高的符合率(總符合率為94.55%～97.45%)[1-3]；但BACTEC MGIT 960 檢測(cè)的平均時(shí)間只需6.7～8 d，明顯短于改良羅氏(L-J)培養(yǎng)基比例法(平均時(shí)間26～42 d)。由上可知，兩種方法DST結(jié)果具有極高的可比性和高度的一致性，兩種方法在培養(yǎng)時(shí)間和DST時(shí)間上卻存在很大差異。雖然BACTEC MGIT 960大大縮短培養(yǎng)和DST時(shí)間，但是其試劑價(jià)格昂貴，現(xiàn)在國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室基本是先用BACTEC MGIT 960進(jìn)行培養(yǎng)，然后用改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行DST。

2. Bact/ALERT 3D：于1996年經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，用于醫(yī)院及科研機(jī)構(gòu)的細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定的液體培養(yǎng)系統(tǒng)，是全自動(dòng)非放射性的快速細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)。該儀器應(yīng)用細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生CO2的原理，通過比色計(jì)傳感器和反射光連續(xù)自動(dòng)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)瓶底部的CO2變色指示劑的顏色變化，來顯示培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。當(dāng)瓶?jī)?nèi)有分枝桿菌生長(zhǎng)時(shí)，產(chǎn)生的CO2滲透至感應(yīng)器，儀器可自動(dòng)連續(xù)檢測(cè)，并自動(dòng)顯示有無分枝桿菌生長(zhǎng)。當(dāng)3D系統(tǒng)顯示陽性時(shí)，按系統(tǒng)操作步驟提示：取出陽性瓶進(jìn)行涂片抗酸染色，確認(rèn)有抗酸桿菌后即進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)。取原始分離瓶菌液，接種于預(yù)先配制好含有藥敏試驗(yàn)所需標(biāo)準(zhǔn)藥物濃度的MB/BacT培養(yǎng)基和空白對(duì)照(藥敏試驗(yàn)菌液需稀釋100倍)MB/BacT培養(yǎng)基中，置3D儀器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)與監(jiān)測(cè)，根據(jù)分枝桿菌生長(zhǎng)的情況對(duì)比判斷對(duì)該藥物的敏感性。42 d未見陽性者可報(bào)告陰性結(jié)果。整個(gè)檢測(cè)過程自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)便，并在一定程度上能消除實(shí)驗(yàn)過程中人為因素導(dǎo)致的偏差。BacT/ALERT 3D法與改良羅氏培養(yǎng)基比例法(L-J比例法)比較，檢測(cè)RFP、INH、Sm和EMB耐藥性的符合率分別為92.00%～96.38%、95.43%～96.38%、78.00%～96.38%和95.43%～100.00%，具有很高的符合率(總符合率為96.38%～100.00%)[4-6]；但BacT/ALERT 3D法的平均檢測(cè)時(shí)間只需8.5～11.8 d，明顯短于L-J比例法(平均檢測(cè)時(shí)間為28.0～42.0 d)。

3.分枝桿菌藥敏檢測(cè)板Sensititre?MYCOTB：美國賽默飛世爾科技有限公司(Thermo Scientific)基于微量肉湯稀釋法原理開發(fā)的分枝桿菌藥敏檢測(cè)板Sensititre?MYCOTB，可檢測(cè)12種一線和二線抗結(jié)核藥物[包括RFP、Rfb、INH、EMB、Sm、氧氟沙星(Ofx)、莫西沙星(Mfx)、阿米卡星(Am)、對(duì)氨基水楊酸(PAS)、乙硫異煙胺(Eto)、卡那霉素(Km)、環(huán)絲氨酸(Cs)]的耐藥性，只需10 d。其優(yōu)點(diǎn)是可獲得抗結(jié)核藥物的最低抑菌濃度(MIC)，為臨床提供更確切的耐藥信息；缺點(diǎn)是實(shí)際應(yīng)用中某些藥物的MIC值不好判讀[7]。

4. 分枝桿菌藥敏檢測(cè)試劑盒(培養(yǎng)法)：國內(nèi)基于在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行微孔板DST(比例法)方法開發(fā)了多個(gè)產(chǎn)品，已獲得我國注冊(cè)證書，如珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司研發(fā)的分枝桿菌藥敏檢測(cè)試劑盒(培養(yǎng)法)可檢測(cè)16種抗結(jié)核藥物[Sm、INH、RFP、EMB、利福噴丁(Rpt)、左氧氟沙星(Lfx)、Am、Cm、丙硫異煙胺(Pto)、對(duì)氨基水楊酸異煙肼(Pa)、Mfx、PAS、克拉霉素(Clr)、利福布汀(Rfb)、Km和氯法齊明(Cfz)][8]。鄭州安圖生物工程股份有限公司生產(chǎn)的MTB藥敏試劑盒，用于檢測(cè)MTB對(duì)臨床常用的14種抗結(jié)核藥物的敏感性。包括14種一、二線抗結(jié)核藥物，主要通過氧化還原指示劑顏色變化顯示MTB是否生長(zhǎng)，當(dāng)指示劑由其氧化狀態(tài)的藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原狀態(tài)的粉色時(shí)，證明MTB的生長(zhǎng)，從而判定菌株耐藥性，該法以顏色變化增加了視覺觀察判斷結(jié)果的敏感性[9]。

(二)分子生物學(xué)檢測(cè)方法

1. Xpert?MTB/RIF：MTB的rpoB基因和突變檢測(cè)試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法；商品名：Xpert?MTB/RIF，以半巢式PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，針對(duì)rpoB基因81 bp的RFP核心區(qū)域設(shè)計(jì)了5個(gè)相互重疊的分子探針，以檢測(cè)MTB是否對(duì)RFP耐藥，另一探針以球芽孢桿菌為內(nèi)對(duì)照，以判斷DNA擴(kuò)增和檢測(cè)效率。該方法是全球唯一的一套將PCR檢測(cè)所需的樣品準(zhǔn)備、DNA擴(kuò)增和檢測(cè)3個(gè)步驟集于一體，在反應(yīng)盒中自動(dòng)化完成的PCR檢測(cè)系統(tǒng)?？紤]到大多數(shù)對(duì)RFP耐藥的MTB同時(shí)也對(duì)INH耐藥，因此，在一定程度上可以通過Xpert?MTB/RIF檢測(cè)出的RFP耐藥結(jié)果來判斷MTB也可能是MDR-MTB，Xpert?MTB/RIF檢測(cè)方法可以作為MDR-TB的一種初步篩查技術(shù)。以比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，Xpert?MTB/RIF檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥的敏感度為86.80%～97.73%，特異度為95.30%～97.95%[10-12]。

2.GenoType?MTBDRplus：為德國Hain Lifescience公司開發(fā)的應(yīng)用PCR-線性雜交酶顯色法檢測(cè)MTB及其耐藥基因的試劑盒。該方法的原理是MTB臨床分離株通過多重PCR擴(kuò)增后，與預(yù)先固定在試紙條上的特異性探針反向雜交，通過檢測(cè)rpoB基因突變確定MTB對(duì)RFP的耐藥性，通過檢測(cè)katG和inhA基因確定MTB對(duì)INH的耐藥性。因此，該方法可以根據(jù)rpoB、katG和inhA基因檢測(cè)結(jié)果快速診斷患者是否為MDR-TB，只需要1～2 d的時(shí)間。GenoType?MTBDRplus與改良羅氏(L-J)培養(yǎng)基比例法比較，檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥性的敏感度和特異度分別為96.55%～100.00%和97.30%～100.00%，兩種方法的符合率為96.00%～99.31%；檢測(cè)MTB對(duì)INH耐藥性的敏感度和特異度分別為84.44%～92.00%和94.93%～100.00%，符合率為92.25%～96.00%；檢測(cè)MTB耐多藥的敏感度和特異度分別為84.81%～97.00%和81.48%～100.00%，符合率為90.70%～96.00%[13-16]。

3.MTB耐藥基因檢測(cè)試劑盒(DNA微陣列芯片法)：由解放軍第三O九醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所研發(fā)、北京博奧生物有限公司注冊(cè)生產(chǎn)，通過檢測(cè)2種一線抗結(jié)核藥物RFP和INH的3個(gè)耐藥基因rpoB、katG和inhA啟動(dòng)子來進(jìn)行耐藥結(jié)核病的診斷。約95%的MTB菌株對(duì)RFP耐藥由rpoB基因突變所致。MTB的rpoB基因突變一般發(fā)生在一個(gè)高度保守的81 bp(第507～533位27個(gè)氨基酸密碼子)組成的區(qū)域內(nèi)。約60%～80%的MTB菌株對(duì)INH耐藥由katG及inhA基因突變所致。根據(jù)這3個(gè)耐藥基因的特異性保守核酸序列，運(yùn)用不對(duì)稱PCR技術(shù)設(shè)計(jì)末端標(biāo)記有熒光分子的引物及寡核苷酸探針，PCR擴(kuò)增后帶有熒光分子的DNA片段與芯片上的探針在一定條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與探針形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過芯片掃描儀掃描雜交后的芯片上特定位置的熒光信號(hào)，從而檢測(cè)出樣品的耐藥基因信息。其中，RFP耐藥相關(guān)基因rpoB基因檢測(cè)6個(gè)位點(diǎn)13種突變基因型。INH耐藥相關(guān)基因katG基因及inhA基因啟動(dòng)子各檢測(cè)1個(gè)位點(diǎn)共3個(gè)突變基因型。該檢測(cè)方法可在獲得DNA后6 h內(nèi)得到結(jié)果。以傳統(tǒng)MTB藥敏試驗(yàn)L-J比例法作為參照標(biāo)準(zhǔn)，DNA微陣列芯片法檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥的敏感度為83.30%～92.73%，特異度為98.19%～100.00%，與L-J比例法或絕對(duì)濃度法的一致率為91.25%～99.40%；檢測(cè)MTB對(duì)INH耐藥的敏感度為72.00%～87.50%，特異度為93.43%～100.00%，與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的一致率為82.50%～98.80%；檢測(cè)MTB耐多藥的敏感度為82.35%～100.00%，特異度為97.30%～100.00%，與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的一致率為96.38%～100.00%[17-19]。

4.結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)：由廈門致善生物科技股份有限公司注冊(cè)生產(chǎn)。該試劑盒應(yīng)用熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥突變[20]，通過在MTB包含rpoB基因81 bp的RFP耐藥決定區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針，4條探針兩兩分布在不同的反應(yīng)管內(nèi)，分別標(biāo)記不同熒光物質(zhì)，4條探針完全覆蓋rpoB決定區(qū)的所有8l bp堿基，且相鄰探針末端有2～3個(gè)堿基的重疊，從而保證了所有位置的突變均可檢測(cè)。每個(gè)標(biāo)本有2個(gè)反應(yīng)管，每種突變檢測(cè)羧基熒光素(FAM)和四氯熒光素(TET)兩個(gè)通道熒光信號(hào)，即每個(gè)標(biāo)本有4個(gè)通道的檢測(cè)結(jié)果。利用rpoB探針與rpoB基因PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物結(jié)合力的不同會(huì)導(dǎo)致熔解溫度(Tm)值的差異，標(biāo)本的熔點(diǎn)與陽性對(duì)照的熔點(diǎn)均一致(誤差不超過1 ℃)時(shí)判定為野生型；4個(gè)通道任一通道中標(biāo)本的熔點(diǎn)低于陽性對(duì)照2℃及以上時(shí)判定為突變型，根據(jù)熔解曲線的Tm值變化就可判斷突變的有無，實(shí)現(xiàn)對(duì)野生型與突變型的檢測(cè)。以傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)L-J比例法或絕對(duì)濃度法或BACTEC MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)為參照標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線檢測(cè)MTB對(duì)RFP的敏感度為90.00%～95.83%，特異度為93.90%～97.42%，符合率為93.00%～99.00%[20-23]。

5.結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)：由廈門致善生物科技股份有限公司注冊(cè)生產(chǎn)。該試劑盒應(yīng)用熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)INH耐藥突變[20]，在MTB的INH靶基因的擴(kuò)增階段設(shè)計(jì)了5條分別標(biāo)記不同熒光物質(zhì)的探針，其中A管3條探針覆蓋ahpC啟動(dòng)子區(qū)-44～-30位點(diǎn)、inhA94密碼子突變和-15～-3位點(diǎn)；B管的2條探針主要檢測(cè)inhA啟動(dòng)子區(qū)-17～-8位點(diǎn)和katG315密碼子突變。每個(gè)標(biāo)本有2個(gè)反應(yīng)管，每種突變檢測(cè)FAM和TET兩個(gè)通道熒光信號(hào)，即每個(gè)標(biāo)本有4個(gè)通道的檢測(cè)結(jié)果。標(biāo)本的熔點(diǎn)與陽性對(duì)照的熔點(diǎn)均一致(誤差不超過1 ℃)時(shí)判定為野生型；4個(gè)通道任一通道中標(biāo)本的熔點(diǎn)低于陽性對(duì)照2 ℃及以上時(shí)判定為突變型。根據(jù)熔解曲線的Tm值變化就可判斷突變的有無，實(shí)現(xiàn)對(duì)野生型與突變型的檢測(cè)。以傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)(L-J比例法)或絕對(duì)濃度法或BACTEC MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)為參照標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)INH耐藥的敏感度為80.00%～87.69%，特異度為94.59%～96.40%，符合率為90.70%～97.00%[20，22-24]。

6.結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)：由廈門致善生物科技股份有限公司注冊(cè)生產(chǎn)，應(yīng)用熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)Sm耐藥突變。MTB對(duì)Sm耐藥的產(chǎn)生是由于核糖體蛋白S12編碼基因(rpsL)和16S核糖體RNA編碼基因(rrs)突變所致，70%以上的基因突變發(fā)生在rpsL43位點(diǎn)。本試劑盒針對(duì)rpsL43、rpsL88、rrs513～517和rrs905～908等4個(gè)區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)，可以檢測(cè)到在這4個(gè)區(qū)域發(fā)生突變的全部菌株[25]。檢測(cè)時(shí)每個(gè)標(biāo)本有兩管在雙色實(shí)時(shí)PCR儀器進(jìn)行。一管檢測(cè)rpsL43、rpsL88密碼子基因突變，另一管檢測(cè)rrs513～517位點(diǎn)和rrs905～908位點(diǎn)基因突變，每種突變檢測(cè)FAM和TET兩個(gè)通道熒光信號(hào)，即每個(gè)標(biāo)本有4個(gè)通道的檢測(cè)結(jié)果。當(dāng)標(biāo)本的熔點(diǎn)與陽性對(duì)照的熔點(diǎn)均一致(誤差不超過1 ℃)時(shí)判定為野生型；4個(gè)通道任一通道中標(biāo)本的熔點(diǎn)低于陽性對(duì)照2 ℃及以上時(shí)判定為突變型。根據(jù)熔解曲線的Tm值變化就可判斷突變的有無，實(shí)現(xiàn)對(duì)野生型與突變型的檢測(cè)。與L-J比例法為參照標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)Sm耐藥的敏感度為78.60%～88.46%，特異度為80.95%～97.35%，符合率為81.82%～94.42%[25-27]。

7.結(jié)核分枝桿菌乙胺丁醇耐藥突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)：由廈門致善生物科技股份有限公司注冊(cè)生產(chǎn)，應(yīng)用熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)EMB耐藥突變。檢測(cè)分兩管在雙色實(shí)時(shí)PCR儀器進(jìn)行，每個(gè)標(biāo)本有2個(gè)反應(yīng)管，一管檢測(cè)embB306和embB497位點(diǎn)基因突變，另一管檢測(cè)embB378～380和embB406位點(diǎn)基因突變，每種突變檢測(cè)FAM和TET兩個(gè)通道熒光信號(hào)，每個(gè)標(biāo)本有4個(gè)通道的檢測(cè)結(jié)果，完成4個(gè)常見突變位點(diǎn)上所有突變類型的檢測(cè)[22]。當(dāng)標(biāo)本的熔點(diǎn)與陽性對(duì)照的熔點(diǎn)均一致(誤差不超過1 ℃)時(shí)判定為野生型；4個(gè)通道任一通道中標(biāo)本的熔點(diǎn)低于陽性對(duì)照2 ℃及以上時(shí)判定為突變型。根據(jù)熔解曲線的Tm值變化就可判斷突變的有無。以L-J比例法為參照標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)EMB耐藥的敏感度為81.97%～88.64%，特異度為75.76%～96.66%，符合率為80.91%～94.17%[25-27]。

8.結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)：由廈門致善生物科技股份有限公司注冊(cè)生產(chǎn)。該試劑盒基于探針熔解曲線分析的原理，以gyrA為靶基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系內(nèi)含有FAM標(biāo)記的gyrA基因88～99位核苷酸密碼子的熒光探針。在PCR擴(kuò)增中產(chǎn)生大量靶基因序列，靶序列與探針雜交，雜交產(chǎn)物產(chǎn)生特定的熔點(diǎn)，通過靶序列熔點(diǎn)的變化，判斷MTB菌株對(duì)FQ藥物的耐藥情況。由于MTB的gyrB基因的突變率非常低，本試劑盒沒有涉及。以7H10瓊脂培養(yǎng)基比例法或Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基比例法為參照標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)FQ藥物耐藥性的敏感度、特異度、符合率分別為96.2%～97.01%、97.6%～99.55%和97.0%～99.21%[28-29]。

9.結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變基因檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法)：由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司注冊(cè)生產(chǎn)。反向點(diǎn)雜交技術(shù)是Saiki等在1989年發(fā)明的，主要用于檢測(cè)引起細(xì)菌耐藥的基因突變。PCR-反向點(diǎn)雜交法是近年發(fā)展起來的集DNA探針、核酸雜交和酶聯(lián)顯色三大技術(shù)于一體的新型基因診斷技術(shù)，用已標(biāo)記的RFP耐藥相關(guān)rpoB基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在固相膜上未標(biāo)記的相應(yīng)寡核苷酸探針雜交的核酸分子雜交的方法檢測(cè)rpoB基因3個(gè)位點(diǎn)6個(gè)基因型的突變。以L-J比例法為參照標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用該方法檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥的敏感度為79.66%～94.90%，特異度為91.84%～100.00%，符合率為87.26%[30-31]。

10.結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒(PCR-測(cè)序法)：由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司注冊(cè)生產(chǎn)，用于對(duì)MTB復(fù)合群的分離培養(yǎng)物進(jìn)行INH耐藥突變檢測(cè)，檢測(cè)位點(diǎn)包括katG基因的315位點(diǎn)(AGC→ACC)和inhA基因啟動(dòng)子區(qū)-15位點(diǎn)(C→T)的突變。

11.結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變基因檢測(cè)試劑盒(PCR-Sanger測(cè)序法)：由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司注冊(cè)生產(chǎn)，可用于檢測(cè)MTB分離株對(duì)RFP耐藥的rpoB基因第507～533中具有明確耐藥的531(TCG→TTG)、526(CAC→TACCGC)、516(GAC→GTC)位密碼子突變。

二、在國際上獲得注冊(cè)證書但尚未進(jìn)入我國的試劑盒

1. GenoType?MTBDRsl： GenoType?MTBDRsl技術(shù)原理同GenoType MTBDRplus，都是基于PCR-線性探針雜交檢測(cè)。2009年，德國Hain Lifescience公司推出了二線抗結(jié)核藥物耐藥快速診斷試劑盒GenoType?MTBDRsl 1.0版，可同時(shí)快速檢測(cè)EMB、FQ、Am、Km和Cm常見耐藥基因型，如可以檢測(cè)FQ類藥物(如Ofx和Lfx)耐藥相關(guān)基因gyrA、氨基糖苷類抗生素(如Km、Am)耐藥相關(guān)基因rrs和EMB耐藥相關(guān)基因embB的突變。穆成等[32]報(bào)道GenoType?MTBDRsl試劑盒檢測(cè)MTB對(duì)Ofx耐藥性的敏感度和特異度分別為83.3%和95.4%，與傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果具有較高的一致性。Barnard等[33]報(bào)道，以BACTEC MGIT 960培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)為參照標(biāo)準(zhǔn)，GenoType MTBDRsl線性探針實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MTB對(duì)Ofx、Am耐藥和XDR-TB的敏感度分別為90.7%、100.0%和92.3%，特異度分別為98.1%、99.4%和99.6%。而2.0版試劑盒除了能檢測(cè)1.0版的gyrA和rrs基因，還能檢測(cè)gyrB和eis啟動(dòng)子基因突變；由于EMB耐藥基因檢測(cè)的敏感度低，2.0版試劑盒不包括EMB耐藥性檢測(cè)。2016年5月2.0版試劑盒雖被WHO推薦，但尚未獲得我國醫(yī)療器械注冊(cè)證書。

2. Genedrivet?Assay：Genedrivet?Assay試劑盒可以檢測(cè)MTB對(duì)RFP的耐藥性。其以rpoB基因位于81 bp的核心區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，檢測(cè)516、526和531位的突變。檢測(cè)原理是用一種簡(jiǎn)單的紙基DNA提取方法，結(jié)合不對(duì)稱PCR和專有的雜交探針技術(shù)，獲得基因型信息。Castan等[34]報(bào)道，用已知數(shù)量的MTB液體培養(yǎng)物制成的模型樣品，Genedrivet?Assay檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥性的總敏感度為72.3%(95%CI：59.8%～82.7%)；對(duì)于菌量>1000菌落形成單位(CFU)/ml的樣品，檢測(cè)敏感度為85.7%；而對(duì)于菌量<100 CFU/ml的樣品，檢測(cè)敏感度為65.9%；檢測(cè)MTB對(duì)RFP的耐藥性的特異度為100.0%(95%CI：83.2%～100.0%)。對(duì)于臨床痰液標(biāo)本用同樣的方法處理，顯示出與模型數(shù)據(jù)具有良好的一致性。用Genedrivet?Assay 檢測(cè)涂片樣本稀少或涂片陰性的結(jié)核病患者的效能與GeneXpert MTB/RIF相當(dāng)[34]。

3. REBA MTB-Rifa?Assay：由韓國注冊(cè)生產(chǎn)的一種基于反向雜交原理的線性探針實(shí)驗(yàn)，其原理是將特定的寡核苷酸探針固定在膜上，并在嚴(yán)格控制的條件下與生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交。該方法由8個(gè)探針組成，其中5個(gè)探針橫跨RFP耐藥決定區(qū)的野生型rpoB序列，它們構(gòu)成了最常見的特異性突變。Cho等[35]報(bào)道，以L-J比例法為參照標(biāo)準(zhǔn)，在492株MTB臨床分離株中，REBA MTB-Rifa?檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥的敏感度和特異度分別為98.1%(211/215)和100.0%(277/277)；對(duì)228例涂陽患者痰標(biāo)本，REBA MTB-Rifa?檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥的敏感度和特異度分別為100.0%(96/96)和100.0%(132/132)。

三、臨床前研究的新方法

1.多重連接依賴式探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA)：由荷蘭科學(xué)家Schouten等于2002年首次報(bào)道，是一種高通量、針對(duì)待測(cè)核酸中的靶序列進(jìn)行定性、定量的分析。該方法只需20 ng/μl DNA即可通過簡(jiǎn)單的雜合、連接、PCR擴(kuò)增及電泳步驟，可在同一反應(yīng)管中檢測(cè)多達(dá)50個(gè)位點(diǎn)的拷貝數(shù)變異，具有高通量、高效率、低成本及自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，在國內(nèi)主要用于產(chǎn)前診斷、腫瘤和動(dòng)物疫病等方面的檢測(cè)。近幾年，國外將該技術(shù)用于檢測(cè)結(jié)核病，但在國內(nèi)還未見此方面應(yīng)用的報(bào)道。MLPA技術(shù)原理主要包括：樣品DNA變性、探針與靶序列的雜交、探針的特異化連接、連接探針的擴(kuò)增和結(jié)果的檢測(cè)分析。其操作只需要一臺(tái)基因擴(kuò)增儀和序列電泳系統(tǒng)，耗時(shí)在24 h以內(nèi)。Santos等[36]報(bào)道，以PCR產(chǎn)物直接測(cè)序?yàn)閰⒄諛?biāo)準(zhǔn)，MLPA和Genotype?MTBDRplus檢測(cè)MTB對(duì)INH耐藥的敏感度分別為92.8%和85.7%，特異度分別為100.0%和97.5%；對(duì)RFP耐藥的敏感度分別為87.5%和100.0%，特異度分別為100.0%和98.8%，結(jié)果表明兩種分子檢測(cè)方法均可用于快速檢測(cè)耐藥結(jié)核病，且具有較高的準(zhǔn)確性。

2.多色熒光實(shí)時(shí)定量PCR (multi-fluorescence quantitative real-time PCR，MF-qRT-PCR)：根據(jù)MTB耐藥突變數(shù)據(jù)庫報(bào)道和測(cè)序結(jié)果中的耐藥突變的關(guān)鍵位置和頻率設(shè)計(jì)用4種熒光標(biāo)記的10個(gè)探針檢測(cè)rpoB、katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC和rrs基因的突變[37]。以L-J比例法為參照標(biāo)準(zhǔn)，MF-qRT-PCR檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥的敏感度和特異度分別為94.6%和100.0%，檢測(cè)MTB對(duì)INH耐藥的敏感度和特異度分別為85.9%和95.3%；以PCR產(chǎn)物直接測(cè)序?yàn)閰⒄諛?biāo)準(zhǔn)，MF-qRT-PCR檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥的敏感度和特異度分別為97.2%和100.0%，檢測(cè)MTB對(duì)INH耐藥的敏感度和特異度分別為97.9%和96.4%。

3. PCR-比色法：PCR-酶聯(lián)寡核苷酸吸附試驗(yàn)(enzyme-linked oligosorbent assay，ELOSA)是一種低成本的基于DNA探針的比色測(cè)定方法，用于MTB對(duì)RFP耐藥性的檢測(cè)[38]。其根據(jù)RFP基因序列設(shè)計(jì)rpoB引物，rpoB基因片段通過PCR用地高辛標(biāo)記，將擴(kuò)增的產(chǎn)物與選擇的等位基因特異性雜交，并將其捕獲到涂有鏈霉親和素的微量滴定板上，通過比色進(jìn)行檢測(cè)。所有探針的檢測(cè)敏感度和特異度均≥96%。

4.數(shù)字PCR：數(shù)字PCR可以檢測(cè)耐藥MTB中的異質(zhì)耐藥性[39]。應(yīng)用雙TaqMan-MGB探針檢測(cè)katG(315)、rpoB(531)、gyrA(94，95)和rrs的野生型和突變型序列，這些基因分別與INH、RFP、FQ和氨基糖苷耐藥相關(guān)。數(shù)字PCR方法能夠檢出MTB混合物中千分之一含量的耐藥菌。相比之下，實(shí)時(shí)PCR或普通PCR檢測(cè)的敏感度低，在MTB混合物中需含10%～50%的耐藥菌方能檢出。

5.焦磷酸測(cè)序：焦磷酸測(cè)序技術(shù)(pyrosequencing)是1987年由Nyren等發(fā)展起來的一項(xiàng)全新的短片段DNA測(cè)序技術(shù)，可以準(zhǔn)確、快速地測(cè)定一段較短的DNA片段，其檢測(cè)精確性可與傳統(tǒng)的Sanger雙脫氧鏈終止法相媲美，且操作極為簡(jiǎn)便。鄭瑞娟等[40]報(bào)道應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)，測(cè)定150株MTB臨床分離株rpoB基因81 bp的RFP抗藥性決定區(qū)(RRDR)，分析rpoB基因突變特點(diǎn)，與絕對(duì)濃度法的符合率是92.7%，與MIC法的符合率是97.8%。

6.全基因組測(cè)序(WGS)：該方法與現(xiàn)有的分子檢測(cè)方法相比，可準(zhǔn)確地提供更多的信息，識(shí)別各種遺傳多態(tài)性，包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)、小片段插入和缺失。目前WGS檢測(cè)MTB對(duì)RFP和INH耐藥性的分析性能特征較高，檢測(cè)RFP耐藥的敏感度和特異度分別為98%(95%CI：93%～98%)和98%(95%CI：98%～100%)；檢測(cè)INH耐藥的敏感度和特異度分別為97%(95%CI：94%～99%)和93%(95%CI：91%～96%)；檢測(cè)其他藥物(Sm、EMB和PZA)耐藥的性能特點(diǎn)差異很大，對(duì)FQ耐藥的分析性能優(yōu)于氨基糖苷類和環(huán)肽類藥物[41]。未來通過采用分散測(cè)序、集中分析模型和半自動(dòng)生物信息學(xué)管道，實(shí)現(xiàn)基于端到端的結(jié)核病診斷系統(tǒng)，這對(duì)患者在臨床治療期間可靠地預(yù)測(cè)藥物敏感性具有重要意義，也為耐藥結(jié)核病患者的臨床管理提供了新的方法。

四、結(jié)語

MTB耐藥性嚴(yán)重影響結(jié)核病的治療，引起耐藥的分子機(jī)制主要是藥物靶基因的改變。盡管現(xiàn)在已經(jīng)有多種方法用來檢測(cè)藥物的耐藥性，但各有局限性，目前快速耐藥檢測(cè)主要是采用分子生物學(xué)的方法，但可檢測(cè)的抗結(jié)核藥物有限，而表型DST方法雖需較長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間,但可了解MTB對(duì)較多抗結(jié)核藥物的耐藥性,兩類方法相互結(jié)合,取長(zhǎng)補(bǔ)短,共同應(yīng)用于臨床,指導(dǎo)結(jié)核病化療方案的制定。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,相信會(huì)不斷研發(fā)出新的耐藥檢測(cè)技術(shù),推廣應(yīng)用于臨床,以解決當(dāng)前仍存在的問題。