姚旭 黎歡 胡益 黃鈞濤 羅琳 沈毅*

1寧波大學醫(yī)學院（浙江315211）

2寧波大學附屬李惠利醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（寧波315040）

鼓膜穿孔（Tympanic membrane perforations,TMP）是耳鼻咽喉科臨床常見疾病，主要病因包括中耳炎癥、外傷以及醫(yī)源性損傷[1-3]。鼓膜之結構分為三層：外側上皮層，中間纖維組織層，內(nèi)側黏膜層，其中纖維組織層含有放射形和環(huán)形纖維，對鼓膜的振動傳聲功能起著重要作用，故鼓膜穿孔常導致傳導性聽力損失。雖然多數(shù)急性鼓膜穿孔可在數(shù)周內(nèi)自愈，但仍有約20%患者不能愈合，當穿孔遷延不愈達3月以上，可定義為慢性鼓膜穿孔[4,5]。慢性鼓膜穿孔可導致聽力下降和中耳反復溢液，甚至可引發(fā)顳骨內(nèi)外并發(fā)癥（如迷路炎、周圍性面癱和Bezold膿腫等）和顱內(nèi)并發(fā)癥（如硬腦膜外膿腫、乙狀竇血栓性靜脈炎、腦膜炎、腦膿腫和腦疝等）[6,7]，據(jù)報道死亡率甚至可高達18.6%[8]。

目前，手術是慢性鼓膜穿孔的主要治療方式，術中采用移植物修復鼓膜，從而重建中耳的傳聲結構。臨床常用的自體移植材料包括顳肌筋膜和軟骨膜，但此類材料均存在自身缺陷，如需術中擴大切口以便取材、再次手術時難以獲取、延長手術時間、增加手術費用等[9]。近年來，隨著生物醫(yī)學和組織工程學技術發(fā)展，許多新型生物材料和治療方法不斷被報道，有望取代常規(guī)手術。在進入臨床使用前，這些新材料和新方法的體內(nèi)安全性及有效性都需行動物實驗予以驗證。但是，目前尚缺乏一種理想的慢性鼓膜穿孔動物模型，故許多研究仍然使用急性鼓膜穿孔動物模型，而動物急性鼓膜穿孔均能在短期內(nèi)迅速自愈，故其不適合用于新材料和新方法臨床前的檢測[10]。由于缺乏理想的動物模型，從而阻礙了慢性鼓膜穿孔治療的新進展[11]。近期，一些新型慢性鼓膜穿孔動物模型相繼被報道，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)許多仍為亞急性或延遲愈合的鼓膜穿孔模型[12]。因此，本文將就慢性鼓膜穿孔動物模型的研究進展進行總結。

1 慢性鼓膜穿孔動物模型的造模方法

迄今為止，許多慢性鼓膜穿孔動物模型的造模方法已被報道，這些方法包括化學方法（如絲裂霉素C、5-氟尿嘧啶和糖皮質(zhì)激素類藥物等）、物理方法（如鼓膜熱燒灼法、鼓膜穿孔邊緣內(nèi)折法和鼓膜反復穿孔法等）、或以上兩種方法的結合。

1.1 化學方法

1.1.1 絲裂霉素C

絲裂霉素C是一種抗腫瘤藥物，通過選擇性阻斷DNA復制，從而抑制細胞有絲分裂和蛋白質(zhì)合成。既往研究顯示，鼓膜穿孔后予以局部使用絲裂霉素C可延遲鼓膜穿孔的愈合，平均延遲時間為44-84天，但不能成功建立慢性鼓膜穿孔動物模型。有學者發(fā)現(xiàn)絲裂霉素C濃度為0.4 mg/ml時為抑制鼓膜成纖維細胞和上皮細胞增殖的最佳劑量，而高濃度絲裂霉素C（2.0 mg/m l）可導致聽力受損和耳漏，并且增加絲裂霉素C的使用時間或次數(shù)對維持穿孔時間并無統(tǒng)計學差異。Esteban等[13]報道絲裂霉素C和氫化可的松聯(lián)用8周后穿孔率為62.5%-77.7%，但在他之前，絲裂霉素C聯(lián)用地塞米松或氫化可的松制備慢性鼓膜穿孔動物模型的成功率為72%-100%[14,15]。

1.1.2 5-氟尿嘧啶

5-氟尿嘧啶（5-FU）是一種胸苷酸合成酶抑制劑，通過抑制脫氧胸苷酸合成酶,從而影響DNA合成。5-FU能干擾RNA中蛋白質(zhì)的合成，并能抑制成纖維細胞增殖和創(chuàng)傷愈合。文獻報道豚鼠鼓膜穿孔后局部使用濃度為50 mg/ml的5-FU可使穿孔延遲愈合最長達3周，但也有學者使用大鼠動物模型，發(fā)現(xiàn)相同濃度的5-FU僅可使穿孔維持14.62天。研究顯示單獨使用5-FU僅能使鼓膜穿孔愈合延遲，故僅適用于慢性鼓膜穿孔動物模型制作的輔助手段。

1.1.3 糖皮質(zhì)激素類藥物

糖皮質(zhì)激素類藥物最早應用于皮膚科領域，此類藥物可通過減少表皮和成纖維細胞復制，延緩巨噬細胞趨化性，減少交聯(lián)及細胞基質(zhì)中重要成分透明質(zhì)酸的合成來發(fā)揮其作用。Spandow和Hellstrom于1993年首次報道在SD大鼠鼓膜穿孔處局部使用氫化可的松，12周后鼓膜穿孔率為33.3%。之后此類藥物常被單獨或聯(lián)合使用以制作慢性鼓膜穿孔動物模型，其中包括地塞米松、氫化可的松和潑尼松龍等[16]，但研究發(fā)現(xiàn)單獨使用潑尼松龍不能使鼓膜延遲愈合。

1.1.4 秋水仙堿

秋水仙堿是一種生物堿，能通過阻止微管聚合來抑制有絲分裂，從而使染色體停滯在分裂中期。Haim等[17]報道，大鼠鼓膜穿孔后予以濃度為0.01%的秋水仙堿液滴耳，最長僅能使穿孔維持3周左右，且高濃度（＞0.01%）秋水仙堿溶液具有耳毒性風險。

1.1.5 Mensa（2-巰基乙磺酸鈉）

Mensa是一種粘液溶解物質(zhì)，通常用來預防某些抗腫瘤藥物引起的尿路上皮損傷。Karli等[18]報道使用Mensa可延長鼓膜切開術后穿孔鼓膜的愈合時間，但最長僅為7天，故其不適合作為慢性鼓膜穿孔的制作方法。

電氣、數(shù)字化與自動化-汽車行業(yè)正在面臨顛覆性變革，先進的電池與電子電氣技術正在重塑汽車設計與制造。漢高下定決心要在本次轉型中發(fā)揮決定性作用，以幫助客戶推動電動交通的未來，并從公司的全面產(chǎn)品和服務組合中獲益，在整個組件價值鏈中提供高效、可靠、安全且可持續(xù)的解決方案。

1.1.6 戊二醛

戊二醛是一種低毒的有機化學溶劑，常用作殺菌消毒劑和防腐劑，可使蛋白質(zhì)變性，并可通過抑制鼓膜中間纖維層的血管再生來延緩創(chuàng)傷愈合。曾有學者用濃度為2%的戊二醛制作狗慢性鼓膜穿孔模型，觀察15周，其穿孔率為57%[19]，但該動物模型之后未見再次報道，且研究發(fā)現(xiàn)使用戊二醛具有潛在耳毒性風險。

1.2 物理方法

1.2.1 鼓膜熱燒灼法

該方法為對鼓膜進行熱燒灼以制作穿孔，觀察期內(nèi)如穿孔愈合則再次予以熱燒灼。既往研究報道顯示該方法的穿孔成功率為69%-83%[20,21]，然而熱燒灼可改變鼓膜的正常結構，并影響后期修復效果的相關研究[21]。

1.2.2 鼓膜穿孔邊緣內(nèi)翻法

自Amoils等人首次報道以來，該方法一直是最常用的慢性鼓膜穿孔動物造模方法，具體為切開鼓膜后，對鼓膜穿孔邊緣的內(nèi)側面進行搔刮，并把穿孔邊緣上皮內(nèi)翻以制作光滑的鼓膜穿孔。既往報道的成功率為55-100%[22]，但近期Emami等[23]報道使用該方法制作栗鼠慢性鼓膜穿孔模型，6周后所有栗鼠的穿孔均愈合，且平均愈合時間為4.8周，這可能與動物個體差異、飼養(yǎng)環(huán)境、手術器械和實驗人員技術水平等因素相關。該方法缺點包括技術操作難度較大，有繼發(fā)膽脂瘤風險，不能使用大鼠而僅能使用栗鼠，因后者外耳道短寬且鼓膜面積較大，然而有些國家例如如澳大利亞禁止飼養(yǎng)栗鼠，故該方法的使用具有一定的局限性[21]。

1.2.3 鼓膜反復穿孔法

1.2.4 錘骨柄部分切除法

據(jù)報道，行鼓膜穿孔后，部分切除錘骨柄并聯(lián)用絲裂霉素C，10周后87%的鼓膜穿孔仍存在。但該方法切除了部分錘骨柄，而既往研究早已證實錘骨柄在鼓膜創(chuàng)傷愈合過程中起著極其重要的作用，因該部位與鼓環(huán)為鼓膜愈合過程中干細胞的增殖區(qū)域，故該方法破壞了鼓膜正常結構，影響鼓膜穿孔愈合過程，從而不利于后續(xù)的鼓膜修復研究[25]。

1.2.5 鼓膜通氣管植入法

臨床上，鼓膜通氣管植入常用來治療保守無效的分泌性中耳炎，但通氣管長期植入后有導致患者慢性鼓膜穿孔的風險，據(jù)報道其發(fā)生率可高達10-30%[26]。因此，近期Wang等[27]利用鼓膜通氣管植入2周后，局部聯(lián)用絲裂霉素C（0.5 mg/ml）和地塞米松法成功建立了大鼠慢性鼓膜穿孔模型，10周后慢性鼓膜穿孔的造模成功率達70%。

2 鼓膜穿孔動物模型的局限性

綜上所述，單獨使用化學藥物如絲裂霉素C、地塞米松、氫化可的松、5-氟尿嘧啶、秋水仙堿或Mensa均只能延長穿孔愈合時間，因而不能制作慢性鼓膜穿孔模型。同樣，單獨使用鼓膜反復穿孔法非但不能使穿孔延遲愈合，反而會促進鼓膜穿孔愈合。目前報道成功且具有應用價值的方法包括絲裂霉素C和地塞米松或氫化可的松的聯(lián)用法、穿孔邊緣內(nèi)翻法、鼓膜通氣管植入并聯(lián)用絲裂霉素C和地塞米松法這三種。首先，絲裂霉素C和地塞米松或氫化可的松的聯(lián)用法在絲裂霉素C的濃度、使用時間和重復次數(shù)以及地塞米松的使用方法（如局部滴注或明膠海綿浸泡留置）、持續(xù)時間和重復次數(shù)等方面均存在爭議，目前尚無統(tǒng)一的標準，仍需后續(xù)進一步的研究證實。其次，鼓膜穿孔邊緣內(nèi)翻法自1992年首次報道以來被廣為接受，是目前最為常用的方法，常與鼓膜熱燒灼或反復穿孔法聯(lián)用，雖然成功率較高，但其操作難度大、對動物種類要求高（需選擇栗鼠等較大動物），近期也屢被質(zhì)疑，故其不是理想的造模方法。此外，鼓膜通氣管植入并聯(lián)用絲裂霉素C和地塞米松法由Wang等[27]研究者首次報道，其方法為鼓膜穿孔后留置鼓膜通氣管2周，并在制作穿孔及移除通氣管時，在穿孔邊緣局部使用地塞米松與絲裂霉素C，觀察8周后約70%的鼓膜穿孔仍存在。其機制為大鼠急性鼓膜穿孔通常在5-12天內(nèi)愈合，而通氣管留置2周可有效降低急性穿孔愈合率，絲裂霉素C可抑制細胞DNA復制和有絲分裂，地塞米松則可延遲巨噬細胞趨化及細胞增殖。雖然其成功率可達70%，但該方法仍較為繁瑣，而理論上理想的慢性鼓膜穿孔模型制作方法應為簡單實用且易于推廣，故今后仍需繼續(xù)探索使其更為簡便有效。

臨床上慢性鼓膜穿孔患者常常伴有咽鼓管功能障礙、耳漏和鼓室黏膜病變，因此制備單一鼓膜穿孔的動物模型往往不足以反映臨床患者所有的病理改變。故Peter等[28]使用聽泡填塞明膠海綿的方法制作了伴有咽鼓管功能障礙的小鼠慢性鼓膜穿孔模型，為今后制作出與臨床患者更為相近的動物模型提供了新思路。此外，近年來研究發(fā)現(xiàn)一些以往報道為成功的動物模型其實并不是真正意義上的慢性鼓膜穿孔動物模型，許多仍為亞急性或愈合延遲的動物模型，并且既往研究缺乏耳內(nèi)窺鏡和病理組織學依據(jù)來科學評價此類動物模型，故今后需要更多研究來對以往報道成功的造模方法進一步明確[10]。

此外，動物種類的選擇也極其重要。目前常用的動物種類包括大鼠、小鼠、豚鼠和栗鼠等，研究者需了解每種動物的優(yōu)缺點及其對應于人類鼓膜的解剖結構差異。許多學者常選用小鼠來制作鼓膜穿孔模型，但小鼠鼓膜的平均表面積僅為3.9 mm2，與人類鼓膜組織（平均表面積65-85 mm2）相比組織太小，因而不易于手術操作[27]。栗鼠鼓膜的平均表面積為56 mm2，其大小和結構與人類鼓膜相似，且栗鼠耳道短、寬、直，故有利于中耳手術操作[21]，但缺點為購買和飼養(yǎng)成本較高，并且澳大利亞等國家禁止進口和飼養(yǎng)栗鼠，因而在這些國家和地區(qū)便不能開展栗鼠的相關實驗。大鼠價格便宜且飼養(yǎng)方便，但其鼓膜組織較小（平均表面積僅11 mm2），也不利于手術操作。豚鼠聽覺靈敏，其鼓膜大小和結構與人類非常相近，雖然外耳道較彎曲，但因外耳道短，故操作也相對容易，故適用于鼓膜穿孔模型的制作。狗的鼓膜平均表面積為30-55 mm2，但其外耳道異常彎曲而不適合手術操作，故近年來鼓膜相關的實驗研究極少選用狗。

總之，理想的慢性鼓膜穿孔動物模型應具備以下特征：①穿孔時間≥8周，且具備病理組織學依據(jù)；②造模方法簡單易學、微創(chuàng)、可重復性高、死亡率小、成功率高、無毒副作用；③動物種類的選擇應是解剖結構最接近人類，且易于手術操作、獲得簡單、價格便宜、易于飼養(yǎng)、對麻醉藥物有較好的耐受性。

3 展望

雖然既往有許多種類的造模方法被報道，但目前仍缺乏一種真正有效、理想的慢性鼓膜穿孔動物模型，從而使得鼓膜穿孔及其修復再生研究領域的發(fā)展受到限制。一種理想的慢性鼓膜穿孔動物模型其穿孔時間應維持在8周以上，并具備病理組織學依據(jù)，而目前多數(shù)文獻報道的模型并不能完全滿足這些要求，故一些以往較常使用的方法其可靠性現(xiàn)屢被質(zhì)疑。此外，實驗動物選擇應當價廉且易于獲取，實驗方法應當操作簡單、可靠性高且易于推廣，這都有待今后的進一步研究。