劉 鑫， 侯若琳， 許凱強(qiáng)， 李佳歡， 林文雄， 鄭明鋒， 傅俊生*

（1．福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2．福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

樺褐孔菌Inonotus obliquus屬于擔(dān)子菌門纖孔菌屬Inonotus[1]，是一種寄生在白樺、榆樹、銀樺等樹種上的白腐菌[2]。其主要分布于俄羅斯北部、北歐、日本北海道以及我國長白山和大興安嶺等北緯40~50°的地區(qū)[3]。它是一種藥用真菌，廣泛用于預(yù)防和治療肝病、糖尿病、心臟病、胃病等疾病，且無明顯的毒副作用[4]。隨著國內(nèi)外對樺褐孔菌的深入研究，發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌提取物具有多種生物活性，主要有抗癌[5-7]、抗氧化[8-9]、增強(qiáng)免疫力[10-11]、降血糖[12]、抗病毒[13]和抗炎[14]，尤其是抗腫瘤方面表現(xiàn)出良好的活性。王文娟[15]等研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌水提醇沉物對人肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用優(yōu)于其他萃取物；Zhao[16]等研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌對宮頸癌HeLa細(xì)胞有明顯的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。

為了進(jìn)一步尋找樺褐孔菌抗乳腺癌的活性部位，作者選取具有高轉(zhuǎn)移能力的惡性乳腺癌MDAMB-231作為細(xì)胞模型，研究了樺褐孔菌提取物不同溶劑萃取部位抗乳腺癌活性，并采用LC-MS/MS初步分析其主要活性部位的化學(xué)成分，為開發(fā)利用樺褐孔菌食藥用資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞：賽百慷生物技術(shù)股份有限公司；樺褐孔菌子實(shí)體：長白山保護(hù)開發(fā)區(qū)福生園參茸有限公司；石油醚、乙醇、乙酸乙酯、二甲基亞砜（DMSO）、正丁醇：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胎牛血清（FBS）：杭州四季青生物工程有限公司；MTT：Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基：Gibco公司；其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KH3200B型超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；N-1000 v-W型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Büchi公司；酶標(biāo)儀：美國Bio-Rad公司；ST16 R型離心機(jī)：美國Thermo公司；MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱：日本三洋公司；XDS-3型倒置生物顯微鏡：意大利Optika公司；LTQ XL型 LC-MS/MS：美國 Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 提取與分離方法 樺褐孔菌干子實(shí)體置于烘箱干燥至恒質(zhì)量，用粉碎機(jī)粉碎后過60目鐵篩，得干粉。取20 g上述所得干粉于500 mL燒杯中，加入75%乙醇400 mL，70℃超聲60 min，重復(fù)提取操作一次，合并提取液，抽濾，收集濾液，倒掉濾渣。減壓濃縮濾液，旋轉(zhuǎn)蒸瓶每次加液約瓶體積的1/3，壓強(qiáng)0.09 MPa，溫度37℃，回收乙醇得浸膏，浸膏質(zhì)量4.8 g。以適量水重懸上述浸膏，浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取4次，合并萃取液并減壓濃縮干燥，得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位，操作流程見圖1。以上4種干膏用DMSO促溶，DMSO體積分?jǐn)?shù)小于0.1%。PBS配制成100 mg/mL的儲(chǔ)存液，保存在4℃冰箱，避光保存，使用時(shí)配制成所需質(zhì)量濃度。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液傳代，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.3.3 MTT法[17]檢測不同萃取部位抗乳腺癌活性將MDA-MB-231細(xì)胞的濃度調(diào)整到1×105個(gè)/mL接種于96孔板，每孔加細(xì)胞懸液200 μL，在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入180 μL新培養(yǎng)基，將其分成空白對照組（0 μg/mL）和給藥組，每組平行設(shè) 4個(gè)重復(fù)；空白對照組加入20 μL不含藥物的培養(yǎng)基，給藥組依次加入樺褐孔菌提取物不同萃取部位藥液20 μL，使其終質(zhì)量濃度分別為 10、20、30、40、50、60、80、100 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸除藥液，每孔加5 mg/mL 的 MTT 20 μL，培養(yǎng)基 180 μL，培養(yǎng) 4 h 后，吸除 MTT，每孔加 150 μL DMSO， 振蕩 15 min，570 nm下測光密度OD值。計(jì)算藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制率，對藥效進(jìn)行初步評價(jià)，并采用lgC-抑制率回歸分析法計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

圖1 實(shí)驗(yàn)操作流程Fig.1 Operation process of the experiment

1.3.4 活性部位對MDA-MB-231細(xì)胞生長的影響將MDA-MB-231細(xì)胞的濃度調(diào)整到1×105個(gè)/mL，接種于6孔板，每孔加2 mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁，吸棄培養(yǎng)液，加入藥物（活性最強(qiáng)萃取部位）質(zhì)量濃度為分別為20、40、80 μg/mL的細(xì)胞培養(yǎng)液2 mL，同時(shí)設(shè)置空白對照組 （0 μg/mL），于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在24 h時(shí)觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)。

1.3.5 劃痕試驗(yàn)[18]檢測活性部位對MDA-MB-231細(xì)胞遷移力的影響 將MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞基本長滿，用200 μL槍頭于細(xì)胞層中縱向劃痕，造成培養(yǎng)細(xì)胞缺損區(qū)域帶，加入一定濃度的含藥（活性最強(qiáng)萃取部位）無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下觀察劃痕處細(xì)胞的覆蓋情況。

1.3.6 LC-M/MS初步分析 LC參數(shù)設(shè)定：色譜柱：Hypersil GOLD C18，100 mm×2.1 mm，5 μm；流動(dòng)相：A：ACN B：0.1%甲酸水溶液； 流速：300 μL/min；進(jìn)樣量：10 μL；洗脫程序見表 1。

表1 LC梯度洗脫程序Table 1 LC gradient elution program

質(zhì)譜參數(shù)設(shè)定見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。統(tǒng)計(jì)描述：計(jì)量資料數(shù)據(jù)用x±s表示。兩組間的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT法檢測樺褐孔菌提取物各萃取部位抗乳腺癌活性

結(jié)果見表3和圖2。藥物作用24 h后，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各萃取部位均可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖，且呈一定的劑量依賴性；根據(jù)IC50的數(shù)據(jù)顯示，藥物對MDA-MB-231細(xì)胞的抑制作用大小依次為：石油醚部位>正丁醇部位>水部位>乙酸乙酯部位；其中乙酸乙酯部位在低質(zhì)量濃度下對細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，隨著質(zhì)量濃度進(jìn)一步的增大，則表現(xiàn)出抑制作用；石油醚萃取部位的抑制強(qiáng)度最大，其作用24 h的IC50值為76.17 μg/mL，因此選石油醚部位進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表3 MTT法檢測樺褐孔菌提取物各萃取部位抗乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活性（%，x±s，n=4）Table 3 Anti-breast cancer（MDA-MB-231） activity of different extraction parts

2.2 樺褐孔菌提取物石油醚部位對MDA-MB-231細(xì)胞生長的影響

上述結(jié)果顯示，石油醚萃取部位相比其它萃取部位對腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用，因此選取該部位進(jìn)一步探究其對細(xì)胞生長的影響。

形態(tài)觀察結(jié)果見圖3。由形態(tài)觀察可知：空白對照組MDA-MB-231細(xì)胞生長正常，加藥組隨著石油醚部位藥物的質(zhì)量濃度升高，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，細(xì)胞逐漸由梭形變成圓球形，并逐漸脫落，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，排列疏松，形態(tài)學(xué)上呈細(xì)胞凋亡狀態(tài)[19]。

2.3 劃痕試驗(yàn)檢測樺褐孔菌提取物石油醚部位對MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。48 h時(shí)空白對照組劃痕區(qū)變窄；加藥組劃痕區(qū)細(xì)胞的遷移速度減慢甚至停滯、細(xì)胞脫落?？梢姌搴挚拙崛∥锸兔演腿〔课粚DA-MB-231細(xì)胞的遷移存在一定的抑制作用。

圖3 不同質(zhì)量濃度的藥物對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of different concentration on the growth of MDA-MB-231 cells

圖4 樺褐孔菌石油醚部位對細(xì)胞遷移的影響Fig.4 Effect of petroleum ether extract fractions on cell migration

2.4 LC-MS/MS對石油醚部位中可能存在的物質(zhì)進(jìn)行初步分析

為進(jìn)一步探究石油醚活性部位其可能含有的化學(xué)成分，采用LC-MS/MS方法對該部位成分進(jìn)行初步分析。經(jīng)LC-MS/MS檢測，樺褐孔菌石油醚萃取物中有14個(gè)離子強(qiáng)度較大的色譜峰被檢測到，對這些峰的一級質(zhì)譜測得精確相對分子質(zhì)量計(jì)算分子式，結(jié)合二級質(zhì)譜的分析以進(jìn)一步解析該14個(gè)色譜峰的結(jié)構(gòu)組成；使用Thermo ScientificTMMass FrontierTM7.0質(zhì)譜解析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，推測對應(yīng)分子可能的結(jié)構(gòu)，分析數(shù)據(jù)見表4。

3 結(jié) 語

近年來，乳腺癌逐漸成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，抗腫瘤藥物的主要作用之一是有效的抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。樺褐孔菌作為食藥用菌，具有抗腫瘤等作用，并且毒副作用小，因此研究其抗乳腺癌活性部位及成分為進(jìn)一步開發(fā)利用樺褐孔菌資源具有重要的意義。

表4LC-MS/MS分析數(shù)據(jù)Table 4LC-MS/MS data

作者采用MTT法檢測樺褐孔菌提取物各萃取部位抗乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活性，結(jié)果顯示樺褐孔菌石油醚萃取部位對MDA-MB-231細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，作用24 h的IC50值為76.17 μg/mL，實(shí)驗(yàn)中樺褐孔菌提取物各萃取部位對MBA-MB-231細(xì)胞的抑制活性表現(xiàn)為：石油醚萃取部位>正丁醇萃取部位>水萃取部位>乙酸乙酯萃取部位；由細(xì)胞形態(tài)觀察可知，隨著石油醚部位藥物的質(zhì)量濃度升高，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，并有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的趨勢；劃痕試驗(yàn)結(jié)果表明樺褐孔菌提取物石油醚萃取部位對MDA-MB-231細(xì)胞的遷移存在一定的抑制作用。

實(shí)驗(yàn)運(yùn)用LC-MS/MS技術(shù)，對樺褐孔菌石油醚萃取部位的化學(xué)組成進(jìn)行了初步分析。在負(fù)離子模式中有14個(gè)離子強(qiáng)度較大的色譜峰下被檢測到，經(jīng)過Mass FrontierTM7.0軟件解析和相關(guān)數(shù)據(jù)庫的檢索，14個(gè)化學(xué)成分被初步表征，其中的10種成分被初 步 鑒 定 ， 分 別 為 ：N1-（4-methoxy-1，2，5-thiadiazol-3-yl）sulfanilamide、氟芐煙酸、脯氨酸-苯丙 氨酸 、5，5-二 苯 基 海 因 、N-[p-[[（2-amino-4-hydroxy-6-pteridinyl）methyl]amino]benzoyl]glutamic acid、Pro-Hyp、沒食子酸、金絲桃素、苦杏仁苷、胭脂紅酸，這些化合物均首次從樺褐孔菌中得到鑒定。有研究報(bào)道金絲桃素對乳腺癌細(xì)胞有一定的抑制活性，而其它初步鑒定的化合物對乳腺癌細(xì)胞的抑制活性未見文獻(xiàn)報(bào)道，關(guān)于何種成分發(fā)揮主要的抗乳腺癌活性還有待進(jìn)一步研究。雖然其中4個(gè)物質(zhì)雖沒有初步鑒定，但亦對它們的相對分子質(zhì)量及分子式進(jìn)行了初步的表征。本研究采用的液質(zhì)聯(lián)用方法目的在于快速表征由多組分構(gòu)成的復(fù)雜化學(xué)體系，能降低傳統(tǒng)分離純化過程中的盲目性，有利于提高活性化合物發(fā)現(xiàn)的概率，為進(jìn)一步開發(fā)和利用樺褐孔菌藥用資源提供科學(xué)的依據(jù)。