李 靜，周明菊，張和倩，宋錦文，張 超，王福生

經(jīng)典的CD4+T細(xì)胞主要在抗體產(chǎn)生、抗原特異性CD8+T細(xì)胞活化、免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮輔助功能。具有直接細(xì)胞毒性的CD4+T細(xì)胞最早在同種異體免疫排斥反應(yīng)中得以描述，這種現(xiàn)象在很長時間內(nèi)被認(rèn)為是由于體外培養(yǎng)產(chǎn)生的假象[1]。經(jīng)系列研究發(fā)現(xiàn)，CD4+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD4+cytotoxic T cells, CD4 CTLs）在人和小鼠中廣泛存在[2]。CD4 CTLs通過II類人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen-II, HLA-II）依賴、抗原特異性的方式識別靶細(xì)胞，分泌細(xì)胞毒性物質(zhì)如顆粒酶、穿孔素等發(fā)揮殺傷效應(yīng)。CD4 CTLs也進(jìn)一步被證實(shí)在病毒感染[2]、腫瘤[2-4]、自身免疫病[2，5-6]、疫苗接種[7]等過程中發(fā)揮重要作用。尤其是在感染性疾病中，包括流感病毒、巨細(xì)胞病毒、EBV、人類乳頭瘤病毒及HIV等都已有廣泛報道。近年來，隨著單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，如單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序、質(zhì)譜流式、T細(xì)胞受體（T-cell receptor, TCR）的單細(xì)胞層面測序分析等，大大促進(jìn)了對CD4 CTLs譜系分化、功能特點(diǎn)的認(rèn)識。在HIV感染中，新近研究表明CD4 CTLs在病毒控制中發(fā)揮了非常重要的作用，并展現(xiàn)出非常好的免疫治療應(yīng)用前景。本文將圍繞近年來國內(nèi)外有關(guān)CD4 CTLs及其在臨床HIV感染中的作用的重要研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 CD4 CTLs的表型與分化機(jī)制

經(jīng)典的免疫學(xué)理論中T細(xì)胞在胸腺中發(fā)育成兩個主要的亞群：HLA-II依賴的CD4+Th和HLA-I依賴的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD8+cytotoxic T cells, CD8 CTLs）。CD4+Th主 要受Th誘導(dǎo)含有BTP / POZ結(jié)構(gòu)域的Kruppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Th-inducing BTB/POZ domaincontaining Kruppel-like zinc-finger transcription factor, ThPOK）控制，而CD8 CTLs主要受Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（Runt related transcription factor 3,RUNX3）調(diào)控。ThPOK和RUNX3互相拮抗，共同調(diào)控T細(xì)胞的分化[8]。CD4 CTLs的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與CD8 CTLs更為接近，在CD4 CTLs中，ThPOK的活性受到抑制，RUNX3活性上調(diào)[2]，這種轉(zhuǎn)變也依賴鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子家族的成員MAZR對ThPOK 沉默子的調(diào)控[9]。

CD4+Th有非常高的異質(zhì)性，可進(jìn)一步分為Th0、Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、濾泡輔助性T細(xì)胞（follicular helper T cell, Tfh）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells, Tregs）等亞群，不同的亞群分別對應(yīng)不同的分化調(diào)控信號、關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、效應(yīng)細(xì)胞因子和功能[7]。不同CD4+Th亞型細(xì)胞其表型也并不是一成不變，在特定生理、病理?xiàng)l件下還能夠相互轉(zhuǎn)化[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，部分CD4+T細(xì)胞能夠在胸腺外進(jìn)一步分化為具有類似CD8 CTLs和NK細(xì)胞的直接細(xì)胞殺傷功能的亞群。CD4 CTLs在不同的病理?xiàng)l件下，主要在機(jī)體外周、腸道和肺等相應(yīng)病灶部位存在[10]，可從Th0[2，11]、Th1、Th2[2]、Th17[2]以及 Tregs[2，12]等效應(yīng)性亞群分化而來。

CD4 CTLs的表型界定目前主要根據(jù)其功能性，包括類似CD8 CTLs和NK細(xì)胞中細(xì)胞殺傷功能相關(guān)的因子，如轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Eomes，效應(yīng)因子顆粒酶、穿孔素、CD107a和殺傷調(diào)控分子NKG2A、NKG2C、NKG2D、KLRG1等。一直以來，對CD4 CTLs的分化缺乏系統(tǒng)認(rèn)識。Takeuchi等[10]發(fā)現(xiàn)，一小部分初始CD4+T細(xì)胞在激活后表達(dá)I類限制性T細(xì)胞相關(guān)分子（class I-restricted T cell-associated molecule, CRTAM），CRTAM+T細(xì)胞在培養(yǎng)后分泌IFN-γ，表達(dá)細(xì)胞殺傷毒性相關(guān)基因，在IL-2存在條件下，高表達(dá)穿孔素，并表現(xiàn)出細(xì)胞毒性功能，由此表明CRTAM+T細(xì)胞是CD4 CTLs的前體。值得注意的是，CRTAM也是CD8 CTLs和NK細(xì)胞的早期活化標(biāo)志物[2]。此外，CD4 CTLs上低表達(dá)CD27和CD28，表現(xiàn)為已高度分化、終末期的T細(xì)胞表型，這可能與持續(xù)的抗原刺激與慢性炎癥的微環(huán)境相關(guān)[2]。近來Patil等[13]通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析的研究顯示，CD4+T細(xì)胞中毒性相關(guān)基因富集在CD4+TEMRA（CD3+CD4+CD45RA+CCR7-）亞群。此外，還鑒定出CD4+TEMRA亞群中IL-7Rhigh的細(xì)胞為CD4 CTLs的前體細(xì)胞。

2 CD4 CTLs的細(xì)胞毒性效應(yīng)機(jī)制

2.1 經(jīng)典途徑 CD4 CTLs發(fā)揮作用的兩種經(jīng)典的細(xì)胞毒性效應(yīng)機(jī)制與CD8 CTLs和NK細(xì)胞類似。第一種是Fas/FasL介導(dǎo)的途徑，效應(yīng)細(xì)胞表面表達(dá)的Fas配體（如FasL、CD95L、CD178）與靶細(xì)胞上表達(dá)的同源Fas受體CD95連接，靶細(xì)胞上Fas的三聚體導(dǎo)致胞內(nèi)FADD/caspase8/c-FLIP誘導(dǎo)死亡信號復(fù)合體的重新招募，最終導(dǎo)致caspase3介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞的死亡[7]。第二種是穿孔素/顆粒酶途徑，細(xì)胞毒素顆粒在特異性TCR信號傳導(dǎo)后發(fā)生胞吐作用，成孔蛋白穿孔素是這些顆粒中作用最好的細(xì)胞毒性分子，它能夠?qū)⒓?xì)胞毒素分子如顆粒酶和顆粒溶素直接轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中。上述兩種途徑并不互斥，可共同發(fā)揮作用，但其偏好會受到刺激信號強(qiáng)度及局部微環(huán)境的影響。例如，在高濃度特異性抗原且IL-2缺失的條件下，CD4 CTLs更傾向于采用Fas/FasL通路殺傷靶細(xì)胞；在低抗原濃度有IL-2存在的條件下，傾向于采用穿孔素/顆粒酶途徑介導(dǎo)的殺傷[14]。

2.2 非經(jīng)典途徑 除上述的兩種途徑外，可能還存在其他非經(jīng)典殺傷途徑。研究發(fā)現(xiàn)，在同時有Fas/FasL和穿孔素表達(dá)缺陷的CTL中仍具有部分細(xì)胞毒活性，進(jìn)一步對CD4 CTLs克隆和殺傷途徑的殺傷性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)穿孔素和Fas途徑僅占其殺傷性的40%[15]。

2.2.1 分泌型、膜型的TNF-α和淋巴毒素 TNF-α和淋巴毒素（lymphotoxin, LT）都存在分泌型和膜型兩種形式。它們都可以介導(dǎo)靶細(xì)胞的死亡。在CD4 CTLs膜上存在膜型TNF-α和LT，它們能以類似Fas/FasL的方式介導(dǎo)靶細(xì)胞的殺傷[16]。

2.2.2 與TNF相關(guān)的殺傷途徑 與TNF類似稍弱的凋亡誘導(dǎo)物（TNF-like weak inducer of apoptosis,TWEAK）屬于TNF超家族，由249個氨基酸組成，屬于二型膜蛋白，胞內(nèi)段與TNF極相似?？扇苄訲WEAK可誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，此殺傷途徑可被caspase抑制劑所阻斷。它也能表達(dá)于CD4 CTLs上，參與誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡，以此途徑殺傷激活的巨噬細(xì)胞。其殺傷途徑與TNF類似，但殺傷能力較弱。

TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL），也屬于TNF超家族，具有與FasL類似的誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡的能力。其分布比FasL更廣泛，能誘導(dǎo)許多細(xì)胞，尤其是血源性細(xì)胞的凋亡。TRAIL可表達(dá)于CD4 CTLs表面，參與誘導(dǎo)激活的巨噬細(xì)胞的凋亡，也可殺傷對Fas/FasL途徑有抗性的黑色素瘤細(xì)胞[16]。

2.2.3 其他 Ohminami等[17]發(fā)現(xiàn)一個急性髓性白血病相關(guān)的DEK-CAN 融合蛋白特異性CD4 CTLs克隆，能以一種非Fas、非穿孔素、非凋亡的方式，對靶細(xì)胞進(jìn)行直接快速的殺傷。這可能是一種全新的CTL殺傷途徑。

3 HIV感染中CD4 CTLs的表型及功能特點(diǎn)

3.1 CD4 CTLs與CD8 CTLs的協(xié)同作用 CD8 CTLs介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫被認(rèn)為是宿主控制急性及慢性感染最重要的途徑。已有研究報道，在HIV感染急性期，CD8 CTLs的出現(xiàn)伴隨著病毒載量的急劇下降[18]。研究發(fā)現(xiàn)，HIV特異性CD8 CTLs識別的表位主要處于包膜蛋白區(qū)，而包膜蛋白區(qū)具有非常高的變異性，因此病毒極易發(fā)生逃逸[19]。首先，病毒能夠通過多種方式逃逸CD8 CTLs的識別，例如下調(diào)被感染宿主細(xì)胞表面的HLA-I的表達(dá)[20]，此外，病毒還能夠產(chǎn)生和積累突變的表位，逃逸CD8 CTLs的識別和殺傷[21]。HIV感染導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞進(jìn)行性減少和免疫缺陷，但在多種病毒感染過程中，CD4 CTLs也被證實(shí)對疾病的控制至關(guān)重要。CD4 CTLs對靶細(xì)胞的識別依賴HLA-II，相較CD8 CTLs依賴的HLA-I、HAL-II遞呈的抗原可以有更大的多樣性和數(shù)量[22]，降低了病毒逃逸識別表位的可能性[23]。因此CD4 CTLs是宿主抗病毒細(xì)胞免疫的重要補(bǔ)充，與CD8 CTLs發(fā)揮協(xié)同作用。

3.2 CD4 CTLs與HIV感染控制的關(guān)系 目前CD4 CTLs相關(guān)的研究主要是HIV感染的臨床病例觀察，尚無臨床試驗(yàn)開展。最近越來越多的研究表明，HIV特異性CD4+T細(xì)胞在控制HIV復(fù)制中可能起關(guān)鍵作用[24-26]，尤其在HIV特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答效率較低的情況下[27]。在HIV-1感染的初期，效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的出現(xiàn)，不僅與急性期病毒載量的變化曲線相關(guān)，并且與早期病毒載量的最低值相關(guān)，表明它參與了病毒的早期控制[7，28]。許多研究團(tuán)隊(duì)針對HIV感染的不同階段進(jìn)行了研究，在早期的研究者中，Appay等[29]檢測到HIV-1感染初期的患者體內(nèi)有大量表達(dá)穿孔素、GzmA、GMP-17/TIA-1的CD4+T細(xì)胞，在慢性感染期會升至更高水平。Johnson等[28]發(fā)現(xiàn)在HIV-1感染的疾病早期（primary HIV-1 infection, PHI）的HIV特異性 CD107a+CD4+T細(xì)胞中，CD107a+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞與HIV特異性CD8 CTLs共享轉(zhuǎn)錄譜，包括GzmA、B、K和穿孔素的表達(dá)，最重要的是HIV特異性CD107a+CD4+T細(xì)胞表現(xiàn)出與HIV特異性CD8 CTLs類似的殺傷活性[28]。除此之外，Soghoian等[27]對PHI的未治療個體進(jìn)行了縱向研究，發(fā)現(xiàn)在感染12個月內(nèi)病毒復(fù)制得到控制的個體與病毒未得到控制的個體相比，HIV特異性CD4+T細(xì)胞顯著擴(kuò)增。與非控制者相比，病毒控制者（即長期無進(jìn)展者）在Gag特異性CD4+T細(xì)胞上具有更高的脫顆粒標(biāo)記CD107a的表達(dá)，并且在基線期時有GzmA+HIV特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答[7，27]，同樣的現(xiàn)象在猿猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）動物感染模型中也得到驗(yàn)證，在刪除了CD8+T細(xì)胞的獼猴中，CD4 CTLs能夠控制SIV的復(fù)制[30]。Sacha等[31]發(fā)現(xiàn)，在精英控制者恒河猴體內(nèi)用抗體去除CD8+T細(xì)胞后，可重新建立Gag和Nef特異性的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答實(shí)現(xiàn)對病毒的控制?？傊陨线@些研究結(jié)果肯定了CD4 CTLs在控制HIV復(fù)制和延緩疾病進(jìn)展方面的作用，詳情見表1。

表1 CD4 CTLs在不同類型的HIV患者中的表型及功能Table 1 Phenotype and function of CD4 CTLs in different groups of HIV patients

HLA的基因型與HIV的感染控制極其相關(guān)。最為熟知的是在精英控制者中HLA-B57、HLA-B27、HLA-B81等HLA-I類分子亞型與HIV感染更好的控制相關(guān)[32]。此外，Benati等[33]最早報道了一類能夠識別HIV主要免疫表位Gag293的CD4 TCR，這類TCR能夠與多類HLA-DR分子結(jié)合，因此也被稱作公共TCR。CD4+T細(xì)胞的公共TCR具有非常高的抗原結(jié)合活性，其存在也是很多精英控制者共有的基因型特征。Galperin等[34]進(jìn)一步的研究表明，這類公共TCR接受不同HLA-DR遞呈的Gag293后，賦予CD4+T細(xì)胞毒性功能，可直接殺傷HIV感染的細(xì)胞。廣泛的HLA-DR交叉限制很可能在HIV感染中具有保護(hù)作用，因?yàn)樗黾恿藛蝹€個體表達(dá)多種限制性HLA-DR等位基因的表位檢測概率，轉(zhuǎn)移表達(dá)高親和力公共TCR的CD4+T細(xì)胞可促使HIV感染的靶細(xì)胞裂解，可作為免疫治療的工具在遺傳背景不同的患者身上實(shí)施，以達(dá)到HIV的功能性治愈。

HIV也能夠通過CD4分子和共受體感染CD4 CTLs細(xì)胞。隨著疾病的進(jìn)展，CD4 CTLs的數(shù)量也會隨著總CD4+T細(xì)胞的減少而減少。這點(diǎn)艾滋病與其他感染性疾病有所不同，因此預(yù)期CD4 CTLs在HIV感染疾病慢性進(jìn)展期的作用較小，相關(guān)的研究并不多。目前尚無關(guān)于CD4+T細(xì)胞計數(shù)低于50的患者研究。經(jīng)過抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療（anti-retroviral therapy, ART）的患者，其體內(nèi)HIV特異性CD4 CTLs在疾病早期增多，抑制病毒的復(fù)制，控制疾病進(jìn)展[21]（如表1）。在HIV感染中，CD4 CTLs除了對病毒感染細(xì)胞進(jìn)行直接識別和殺傷外，也能以非細(xì)胞毒性機(jī)制發(fā)揮作用，Buggert等[21]近期發(fā)現(xiàn)體內(nèi)T-bet和Eomes雙陽性的CD4 CTLs細(xì)胞是產(chǎn)生β-趨化因子的主要CD4+T細(xì)胞亞群，其分泌的β趨化因子MIP-1α和MIP-1β能夠競爭性結(jié)合CCR5，抑制HIV入侵。另有文獻(xiàn)報道，CD4 CTLs與常規(guī)CD25+FoxP3+CD4+T 細(xì)胞相比對HIV感染更耐受[35]，機(jī)制也可能如此，因此有研究認(rèn)為這些功能特性提高了機(jī)體對HIV感染的抵抗力[36]。

3.3 CD4 CTLs在HIV疫苗設(shè)計中的應(yīng)用 在探索HIV治愈策略中誘導(dǎo)保護(hù)性抗體和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答是預(yù)防HIV感染的主要疫苗策略，而特異性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)是誘導(dǎo)產(chǎn)生有效抗體和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的關(guān)鍵。部分病毒特異性CD4+T細(xì)胞可能作為HIV感染的首要靶點(diǎn)，在獼猴艾滋病模型中，疫苗誘導(dǎo)的病毒特異性CD107a-CD4+T細(xì)胞在感染HIV后大量減少，但這項(xiàng)研究同時發(fā)現(xiàn)，疫苗誘導(dǎo)的CD107a+CD4+T細(xì)胞在病毒攻擊后較少耗竭，這意味著誘導(dǎo)這群細(xì)胞可能是治療艾滋病的另一種途徑[37]。有研究證實(shí)記憶性CD4+T的次級免疫效應(yīng)功能高度依賴于炎癥環(huán)境，而IL-12和I型IFN的阻斷對記憶性CD4+T細(xì)胞的效應(yīng)性分化有相反作用，進(jìn)一步探討炎癥環(huán)境是如何影響它的次級免疫效應(yīng)將使人們更好的了解目前的疫苗策略。記憶性CD4+T細(xì)胞在參與首次和次級免疫應(yīng)答過程中介導(dǎo)的保護(hù)機(jī)制可能是不同的，在制定有效的疫苗接種策略時須更好的了解記憶性CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的病原體清除的功能機(jī)制，同樣對相關(guān)細(xì)胞因子作用途徑的研究也十分必要[38]。

3.4 組織中CD4 CTLs的特點(diǎn) 關(guān)于HIV-1感染者外周血方面的研究已有較多報道[8]，淋巴細(xì)胞主要存在于淋巴器官中，外周血中淋巴細(xì)胞的含量僅占總淋巴結(jié)的2%，而淋巴器官又是HIV主要的病毒庫[21，39]，所以淋巴結(jié)中是否也存在特異性的CD4 CTLs，以及其在HIV-1感染中發(fā)揮的作用是一個非常重要的問題。另有研究報道，在腸道黏膜組織中及炎癥部位可顯著觀察到CD4 CTLs的存在，并可能在抗感染和免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[10]。

新近研究發(fā)現(xiàn)，在HIV感染者外周血中存在大量的CD4 CTLs，但在急性感染早期淋巴結(jié)中僅存在極少量的CD4 CTLs，而在慢性期的淋巴結(jié)中幾乎不存在，所以HIV特異性CD4 CTLs可能并不是淋巴結(jié)中控制病毒的主要成分。淋巴結(jié)中β趨化因子的產(chǎn)生缺乏，也說明了其在HIV的控制中作用甚微。在感染后病毒血癥高峰期間，HIV特異性CD4 CTLs應(yīng)答在外周血中最高，且與T-bet、穿孔素、MIP-1α等的產(chǎn)生增加相符[21]。值得注意的是，先前研究表明淋巴結(jié)中的T細(xì)胞在獲得細(xì)胞毒性后從組織進(jìn)入血液，盡管慢性淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒感染患者淋巴結(jié)中特異性CD8+T細(xì)胞在急性感染期間可脫粒，但它們并不能有效的殺傷靶細(xì)胞[21，40]。該研究結(jié)果也適用于慢性HIV感染患者的數(shù)據(jù)，表明不同亞群的CD4+T細(xì)胞在淋巴結(jié)和外周血之間存在著脫?，F(xiàn)象，但細(xì)胞毒性分子表達(dá)水平低且免疫突觸受損，它們傾向于CXCR5+表型，提示是一種獨(dú)特的Tfh亞群脫粒，這種與眾不同的表型，至少不是與細(xì)胞毒性因子和β趨化因子分泌功能相關(guān)，意義還有待進(jìn)一步研究。本文對文獻(xiàn)中已報道的在HIV感染中CD4 CTLs的表型及功能等做了梳理，詳見表1。

4 小 結(jié)

CD4 CTLs是一種非常重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，廣泛參與感染性疾病的免疫應(yīng)答過程。在HIV感染中，病毒特異性CD4 CTLs通過分泌多種細(xì)胞毒性介質(zhì)發(fā)揮殺傷作用以保護(hù)機(jī)體，但是它優(yōu)先耗盡的事實(shí)使人對其有效的促進(jìn)HIV控制的能力產(chǎn)生懷疑；CD4 CTLs在HIV感染早期可以控制病毒的復(fù)制，但在疾病急性期病毒特異性CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的各種短期和長期抗病毒作用的相互作用仍須深入探索；在慢性感染期它依然存在，在感染晚期可能啟動免疫功能來控制病毒血癥，但最終會喪失，提示可能存在替代因子在疾病進(jìn)展的后期發(fā)揮作用，但這些反應(yīng)的動力學(xué)和特征尚未得到評估；表達(dá)抗原高親和力、廣泛交叉限制性的公共TCR CD4+T細(xì)胞，分化為CD4 CTLs直接殺傷HIV感染的細(xì)胞，能夠控制HIV的控制者是否表現(xiàn)出MHC-II介導(dǎo)的選擇壓力，是否可通過治療干預(yù)來增強(qiáng)這些反應(yīng)，這些都值得進(jìn)一步研究，為HIV感染的治愈探索新策略。