蔣 參 熊慧生 巫桁錁 文 軍 梁 玲

(重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/重慶市腫瘤研究所/重慶市腫瘤醫(yī)院中醫(yī)腫瘤科，重慶 400030)

肝癌是我國高發(fā)的一類惡性腫瘤，是造成我國癌癥死亡的第四大原因[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年我國肝癌新增病例達(dá)到466 100人，肝癌死亡人數(shù)達(dá)到422 100人，并且其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[2]。手術(shù)切除和肝移植是目前肝癌最主要的治療手段，但僅有30%肝癌患者適合手術(shù)治療[3,4]。并且超過80%的患者確診時(shí)已處于肝癌晚期，即使經(jīng)過治療也不能較好的改善患者生活質(zhì)量， 5年內(nèi)生存率僅有15%，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康[5,6]。因此，尋找新的肝癌治療藥物是延長肝癌患者生存時(shí)間、降低肝癌死亡率的關(guān)鍵。近年來天然產(chǎn)物的抗癌活性受到廣泛關(guān)注[7]。金絲桃苷(Hyperoside,HS)是金絲桃的主要活性成分，可通過誘導(dǎo)肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤活性[8-10]。也有研究表明HS可能具有抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖的活性[11]，但作用機(jī)制還未見報(bào)道。因此，本研究以肝癌細(xì)胞HepG2為研究對象，探究HS對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)藥物 HS購自美國Sigma公司，貨號為1335202，分子量為464.38，純度≥97%。用DMSO助溶，用無血清培養(yǎng)液配制成5 μmol/L的高濃度HS溶液，臨用前用正常培養(yǎng)液稀釋，DMSO終濃度不超過0.1%。

1.1.2細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞系HepG2購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)，貨號為HB-8065TM。用含5%胎牛血清、100 mg/ml 鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔天換液一次，細(xì)胞融合度達(dá)到85%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.1.3試劑 RPMI1640培養(yǎng)液，特級胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Invitrogen公司。MTT購自美國Sigma公司。DAPI染色液購自北京索萊寶公司?？筆53、半胱天冬氨酸酶-9(Caspase-9)和Caspase-3抗體購自美國CST公司，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購自英國Abcam公司。

1.1.4儀器 多功能酶標(biāo)儀、電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司;倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；流式細(xì)胞儀購自美國ThermoFhisher公司。

1.2方法

1.2.1MTT檢測細(xì)胞活性 將細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，用含有不同濃度HS(0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、500 nmol/L)的培養(yǎng)液處理細(xì)胞，24 h后每孔加入10 μl MTT溶液于37℃繼續(xù)孵育4 h。4 h后小心吸去上清液，每孔加入150 μl DMSO，待結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀檢測吸光度，檢測波長為570 nm，計(jì)算細(xì)胞活性，選取最佳用藥濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

將細(xì)胞隨機(jī)分為HepG2組、HS(10 nmol/L)組、HS(20 nmol/L)組和HS(50 nmol/L)組，每組6個(gè)復(fù)孔。用0、10、20和50 nmol/L的HS處理細(xì)胞，MTT法檢測HS處理細(xì)胞0、2、3和4 d后各組細(xì)胞的增殖倍數(shù)(增殖倍數(shù)=各組OD值/第0天HepG2組OD值)，繪制生長曲線。

1.2.2流式檢測細(xì)胞凋亡 用0.25%胰蛋白酶收集不同濃度HS(10、20、50 nmol/L)處理的細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，用Binding buffer洗滌細(xì)胞一次，重懸沉淀后加入5 μl FITC-Annexin V和5 μl PI(10 mg/ml)溶液，室溫避光孵育15 min，最后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.3免疫熒光檢測核皺縮情況 將細(xì)胞傳代培養(yǎng)于12孔板中，用HS(10、20、50 nmol/L)處理細(xì)胞。48 h后棄去上層培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞三次，滴加DAPI即用液，每孔100 μl，室溫避光染色10 min，用PBS洗去未結(jié)合的DAPI溶液，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核皺縮情況，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)=核皺縮細(xì)胞核數(shù)/細(xì)胞核總數(shù)×100%)。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度并調(diào)平。取等量的蛋白質(zhì)用10%SDS-PAGE進(jìn)行分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。隨后用5%脫脂奶粉封閉，依次加入適宜濃度一抗(P53,1∶1 200;Caspase-3,1∶1 000;Casapse-9,1∶1 000)和二抗，最后滴加ECL進(jìn)行曝光顯影。凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白質(zhì)條帶圖片，Image J對蛋白質(zhì)條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1金絲桃苷對肝癌細(xì)胞增殖的影響 如圖1B所示，HS濃度達(dá)到100 nmol/L及以上時(shí)，HepG2細(xì)胞活性明顯降至80%以下，表明HS濃度高于100 nmol/L時(shí)對HepG2細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒性。因此選擇10、20、50 nmol/L三個(gè)濃度的HS進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與HepG2組比較，HS(20 nmol/L)處理細(xì)胞4 d能顯著降低肝癌細(xì)胞增殖倍數(shù)(P<0.05，圖2)；HS(50 nmol/L)處理細(xì)胞3 d和4 d均能顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖(P<0.05，圖2)，表明HS具有抑制肝癌細(xì)胞增殖的活性。

圖1 金絲桃苷對HepG2細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of HS on cell viability of HepG2 cellsNote: A.The chemical structure of HS；B.Cells were treated with Hs at different concentrations,and MTT assay was performed for cell viability.n=3,each experiment was repeated at least three times.

圖2 金絲桃苷對肝癌細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of HS on cell proliferation of hepatoma carcinoma cellsNote: Cells were treated with HS(10,20,50 nmol/L) for 0,1,2,3 and 4 d.Cell growth was determined by MTT assay.*.P<0.05 versus HepG2 group,n=6.

圖3 金絲桃苷對肝癌細(xì)胞凋亡率的影響Fig.3 Effect of HS on cell apoptosis rate of hepatoma carcinoma cellsNote: Cell apoptosis was determined by flow cytometry.*.P<0.05 versus HepG2 group.n=6.

2.2金絲桃苷對肝癌細(xì)胞凋亡的影響 與HepG2組比較，HS(10 nmol/L)組、HS(20 nmol/L)組和HS(50 nmol/L)組細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05，圖3)；免疫熒光結(jié)果顯示，HS(10 nmol/L)組、HS(20 nmol/L)組和HS(10 nmol/L)組皺縮細(xì)胞核數(shù)多于HepG2組，凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與HepG2組比較明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)，提示HS可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

圖4 金絲桃苷對肝癌細(xì)胞核皺縮的影響Fig.4 Effect of HS on nuclear shrinkage of hepatoma carcinoma cellsNote: Nuclear shrinkage was visualized by immunofluorescence.*.P<0.05 versus HepG2 group,n=6.

圖5 金絲桃苷對P53/Caspase信號通路的影響Fig.5 Effect of HS on P53/Caspase signaling pathwayNote: Western blot was performed for protein levels of P53,Caspase-9 and Caspase-3,GAPDH was used as loading control.*.P<0.05 versus HepG2 group,n=6.

2.3金絲桃苷對P53/Caspase信號通路的影響Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HS(20 nmol/L)組和HS(50 nmol/L)組細(xì)胞P53、Caspase-9和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平與HepG2組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)，表明HS可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞P53/Caspase信號通路激活。

3 討論

細(xì)胞增殖不受控制是癌癥發(fā)生的主要機(jī)制之一。天然產(chǎn)物提取物Goniothalamin可抑制多類結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗癌作用[12]。北美刺人參也可通過抑制胰腺癌細(xì)胞增殖減緩腫瘤的生長[13]。HS是金絲桃的主要活性成分。研究表明，HS可抑制多類癌細(xì)胞增殖。Liu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HS能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖相關(guān)通路激活，從而抑制肺癌細(xì)胞增殖。HS還能抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖[15]。也有研究發(fā)現(xiàn)，HS對肝癌細(xì)胞增殖也具有一定的抑制作用[11]。本文研究也發(fā)現(xiàn)，高濃度的HS能降低肝癌HepG2細(xì)胞活性。在無明顯細(xì)胞毒性的劑量下，HS作用3、4 d能顯著降低肝癌細(xì)胞增殖倍數(shù)，進(jìn)一步表明HS具有抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。

研究表明，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是大多數(shù)抗癌藥物抑制癌癥發(fā)展的作用機(jī)制[16-19]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)多類天然產(chǎn)物提取物也能通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌作用[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，蟾酥靈能通過增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[21]。藤黃酸可調(diào)控線粒體硫氧還原蛋白還原酶的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡[22]。Li等[23]研究發(fā)現(xiàn)，桔梗皂苷D可誘導(dǎo)促凋亡蛋白PARP和Bax的表達(dá)，從而降低肝癌細(xì)胞存活率。也有研究表明，金絲桃提取物HS能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡減緩多類癌癥的發(fā)展，但其對肝癌細(xì)胞凋亡的作用還較少見報(bào)道[24-26]。本文研究發(fā)現(xiàn)，HS能顯著升高肝癌細(xì)胞凋亡率，并表現(xiàn)劑量依賴性，提示HS能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，并隨劑量的升高作用逐漸增強(qiáng)。此外，免疫熒光結(jié)果顯示，HS還能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞核皺縮。細(xì)胞核形態(tài)改變是細(xì)胞凋亡的主要特征之一，生姜提取物可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞核皺縮，降低癌細(xì)胞活性[27,28]。怡紅草素在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞凋亡的同時(shí)，細(xì)胞核也出現(xiàn)明顯改變[29]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明HS能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗肝癌作用。

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，由多條信號通路共同調(diào)控，這些信號通路主要通過改變線粒體通透性，誘導(dǎo)線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過程[14,30]。Caspase家族是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者，Caspase家族蛋白的激活可誘導(dǎo)DNA降解、介導(dǎo)DNA損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[31]。P53是Caspase家族蛋白的上游調(diào)控因子，在氧化應(yīng)激、紫外照射等多種應(yīng)激條件誘導(dǎo)DNA損傷過程中均呈高表達(dá)狀態(tài)[32,33]。P53作用于線粒體可誘導(dǎo)細(xì)胞色素C表達(dá)，細(xì)胞色素C可直接誘導(dǎo)Caspase-9活化，活化的Capase-9可進(jìn)一步促進(jìn)Caspase-3激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[34,35]。P53介導(dǎo)的P53/Caspase細(xì)胞凋亡信號通路是多類化療藥物治療癌癥的重要機(jī)制之一。Alhazmi等[36]研究表明，黑種草種子提取物可通過激活P53/Caspase信號通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。紫草素可通過誘導(dǎo)P53表達(dá)升高Caspase-9表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[37]。本研究采用Western blot法檢測了HS處理肝癌細(xì)胞后，細(xì)胞P53、Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HS在誘導(dǎo)P53表達(dá)的同時(shí)也能升高肝癌細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)水平，提示其能夠誘導(dǎo)P53/Caspase信號通路的激活，可能是HS誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制之一。

綜上所述，HS可抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，并能促進(jìn)凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)，其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)P53/Caspase信號通路的激活有關(guān)。本研究僅初步探討了HS抗肝癌的作用機(jī)制，之后將通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并進(jìn)一步探究其具體的分子作用機(jī)制，為臨床開發(fā)新的肝癌治療藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。