吳應(yīng)強(qiáng) 葉久茂 范騰陽 吳進(jìn)霞 陳小燕

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科,遵義 563000)

高血壓以動(dòng)脈血壓增高為主要特征，可并發(fā)腦、心臟、血管和腎臟等靶器官功能損傷，致死率較高[1]。高血壓性心臟病(Hypertensive heart disease，HHD)是由高血壓引起的心臟靶器官損害，主要表現(xiàn)為左心室受損、左心室肥大等臨床癥狀[2]。HHD患者若不及時(shí)治療，病情不斷惡化和加重，會(huì)導(dǎo)致左心衰竭。目前，HHD發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，但研究者認(rèn)為神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)功能紊亂是導(dǎo)致發(fā)病的重要原因[3,4]。因此從神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)進(jìn)行深入探究可望成為臨床治療HHD的新策略。針對(duì)HHD的防治，中藥在改善臨床癥狀，減少并發(fā)癥，副毒作用相對(duì)較輕等方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。丹參具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌、抗心律失常、提高心肌耐缺氧能力、抗氧化和清除自由基和抗炎等作用，被用于治療心腦血管、癌癥等疾病。本研究通過建立HHD大鼠模型，并注射不同濃度丹參乙醇提取物溶液，初步探討丹參提取物對(duì)HHD大鼠神經(jīng)免疫的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1材料 50只清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重200～260 g，購自上海市醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～27℃，相對(duì)濕度45%～75%，噪音85分貝以下，12 h光照、12 h黑暗，通風(fēng)換氣8～12次/h，自由進(jìn)食和飲水，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK 20170008。

1.2方法

1.2.1HHD大鼠模型制備 隨機(jī)取40只大鼠HHD模型采用結(jié)扎腹主動(dòng)脈法，稱量大鼠體重，按1.0 mg/kg腹腔注射25 g/L水合氯醛麻醉。麻醉后仰臥位固定，從腹前正中縱向開約1.5～2 cm切口，小心鈍性分離使腹主動(dòng)脈暴露，取用直徑1.7 mm探針結(jié)扎到腹主動(dòng)脈，緩慢抽出探針后，形成腹主動(dòng)脈狹窄(約50%狹窄)，在腹腔注射10 U/ml青霉素防止感染，之后關(guān)腹縫合。造模1周后檢測大鼠心功能和血壓，若左心室收縮末期內(nèi)徑(Left ventricular end systolic diameter，LVESD)>10 mm，舒張末期內(nèi)徑(Left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)>8 mm，動(dòng)脈收縮壓(Systolic blood pressure,SBP)>150 mmHg、舒張壓(Diastolic blood pressure,DBP)>120 mmHg，則表示造模成功。

1.2.2分組及干預(yù)方法 將造模成功的SD大鼠隨機(jī)分為A組、B組、C組和D組，每組10只，未造模的10只大鼠記為對(duì)照組。A組和對(duì)照組腹腔注射生理鹽水5 ml，B組、C組和D組分別腹腔注射0.75 ml/mg、1.5 ml/mg、3.0 ml/mg各5 ml丹參乙醇提取物溶液，每周稱重1次，根據(jù)體重調(diào)整藥量，每周注射1次，注射持續(xù)4周。

1.2.3心功能和血壓指標(biāo)檢測 注射4周后，仰臥位固定大鼠，剪凈左前胸毛，使用頻率 10.0 MHz探頭心臟超聲診斷儀進(jìn)行心功能檢測檢查，連續(xù)測量3個(gè)不同心動(dòng)周期LVESD及LVEDD，取平均值，并計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular reject fraction,LVEF)。

采用尾動(dòng)脈無創(chuàng)性血壓測量動(dòng)脈SBP、DBP，固定盒固定后放入固定架，在接近尾根部通過加壓套插入血壓測量儀，調(diào)節(jié)鼠尾壓迫片使傳感片緊貼尾動(dòng)脈，待大鼠脈搏穩(wěn)定后進(jìn)行測量。

1.2.4神經(jīng)因子指標(biāo)檢測 注射結(jié)束12 h后，取各組大鼠外周血5 ml，3 000 r/min 4℃離心15 min 取上清，存于-80℃冰箱待檢。采用酶聯(lián)免疫試劑盒法(ELISA檢測試劑盒，上海江萊生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：201608072)測定血漿中 P物質(zhì)(Substance P,SP)、血管活性腸肽(Vasoactive intestinal peptide,VIP)、去甲腎上腺素(Noradrena-line,NE)、血管緊張素Ⅱ(Angiotensin,AngⅡ)水平，每孔加入待測樣本10 μl，37℃溫育30 min，洗滌4次后，加入酶標(biāo)工作液50 μl，溫育洗滌，加入顯色劑各50 μl，避光顯色15 min，再加入終止液50 μl，終止反應(yīng)。450 nm波長測量各孔吸光度值(OD)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算3種神經(jīng)因子水平。具體操作按照試劑盒說明書。

1.2.5免疫因子指標(biāo)檢測 注射結(jié)束12 h后，采集大鼠外周血5 ml，3 000 r/min 4℃離心15 min 取上清，采用ELISA法定量測定血液中白細(xì)胞介素10(Interleukin-10,IL-10)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)水平，具體操作同1.2.4，均借助酶聯(lián)免疫試劑盒法(ELISA檢測試劑盒，上海江萊生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：201608072)完成操作。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血液自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cell,NK)、T淋巴細(xì)胞亞群(T cell subset)CD4+、CD8+活性，并計(jì)算CD4+/CD8+比值。

1.2.6觀察指標(biāo)

1.2.6.1心功能和血壓指標(biāo)對(duì)比，包括LVEDD、LVESD、LVEF、SBP、DBP。

1.2.6.2神經(jīng)因子指標(biāo)對(duì)比，包括SP、VIP、NE、AngⅡ水平。

1.2.6.3免疫因子指標(biāo)對(duì)比，包括IL-10、TNF-α、NK、CD4+/CD8+水平。

2 結(jié)果

2.1心功能和血壓指標(biāo)對(duì)比 對(duì)照組、A、B、C、D組LVEDD、LVESD、LVEF、SBP、DBP比較有顯著性差異(P<0.05)。A、B、C、D組LVEF顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，LVEDD、LVESD、SBP、DBP顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；B、C、D組LVEF顯著高于A組(P<0.05)，LVEDD、LVESD、SBP、DBP顯著低于A組(P<0.05)；C、D組LVEF顯著高于B組(P<0.05)，C、D組LVEDD、LVESD、SBP、DBP顯著低于B組(P<0.05)；D組LVEF顯著高于C組(P<0.05)，LVEDD、LVESD、DBP顯著低于C組(P<0.05)。見圖1～5所示。

2.2神經(jīng)因子指標(biāo)對(duì)比 如表1所示，對(duì)照組、A、B、C、D組SP、VIP、NE、AngⅡ比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，A、B、C、D組SP、VIP顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，NE、AngⅡ均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，B、C、D組SP、VIP顯著高于A組(P<0.05)，NE、AngⅡ均顯著低于A組(P<0.05)；C、D組SP、VIP顯著高于B組(P<0.05)，NE、AngⅡ均顯著低于B組(P<0.05)；D組(P<0.05)顯著高于C組，NE、AngⅡ均顯著低于C組(P<0.05)。

2.3免疫因子指標(biāo)對(duì)比 如表2所示，對(duì)照組、A、B、C、D組IL-10、TNF-α、NK、CD4+/CD8+比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，A、B、C、D組IL-10、NK、CD4+/CD8+顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，TNF-α顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；B、C、D組IL-10、NK、CD4+/CD8+顯著高于A組(P<0.05)，TNF-α顯著低于A組(P<0.05)；C、D組IL-10、NK、CD4+/CD8+顯著高于B組(P<0.05)，TNF-α顯著低于B組(P<0.05)；D組IL-10、NK、CD4+/CD8+顯著高于C組(P<0.05)。

圖1 LVEDD比較Fig.1 Comparison of LVEDD

圖2 LVESD比較Fig.2 Comparison of LVESD

圖3 LVEF比較Fig.3 Comparison of LVEF

圖4 SBP比較Fig.4 Comparison of SBP

GroupsnSP(pg/L)VIP(pg/L)NE(ng/ml)AngⅡ(pg/ml)A group10275.64±18.2018.54±3.2144.02±2.21170.41±10.12B group10453.13±25.021)26.05±5.131)39.14±1.871)143.17±9.811)C group10594.05±24.311)2)28.17±4.101)2)36.20±1.011)2)131.56±7.151)2)D group10542.12±26.181)2)3)38.89±6.241)2)3)34.85±1.241)2)3)124.38±6.241)2)3)Control group10214.74±12.511)2)3)4)14.32±3.011)2)3)4)50.72±2.981)2)3)4)198.52±12.311)2)3)4)F729.74153.26761.82562.319P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the A group,1)P<0.05;compared with the B group,2)P<0.05;compared with the C group,3)P<0.05;compared with the D group,4)P<0.05.

GroupsnIL-10(pg/ml)TNF-α(ng/ml)NK(%)CD4+/CD8+A group1026.86±6.142.78±0.1914.17±1.241.23±0.08B group1034.13±6.831)1.76±0.151)19.58±1.191)1.36±0.141)C group1042.35±7.111)2)1.61±0.111)2)21.49±1.221)2)1.52±0.101)2)D group1051.64±6.971)2)3)1.50±0.141)2)23.73±1.181)2)3)1.69±0.121)2)3)Control group1022.41±5.181)2)3)4)2.96±0.191)2)3)4)10.73±1.051)2)3)4)1.00±0.071)2)3)4)F23.541159.743222.18663.174P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the A group,1)P<0.05;compared with the B group,2)P<0.05;compared with the C group,3)P<0.05;compared with the D group,4)P<0.05.

圖5 DBP比較Fig.5 Comparison of DBP

3 討論

HHD是高血壓晚期的一種并發(fā)癥，其主要是收縮壓升高，心室壁壓力負(fù)荷，導(dǎo)致左心室心肌舒張性功能不全，心室肥厚等心功能障礙癥狀。近年來，研究者從神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)方面對(duì)HHD發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討，認(rèn)為與神經(jīng)內(nèi)分泌改變有關(guān)，如神經(jīng)因子、IL-10、TNF-α表達(dá)水平、T淋巴細(xì)胞群活性與血壓和心臟功能相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)某些神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，既可作用于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，又對(duì)免疫系統(tǒng)有影響，共同參與機(jī)體調(diào)節(jié)[5]。T淋巴亞細(xì)胞群反映了機(jī)體的免疫功能，同時(shí)免疫細(xì)胞也可分泌多種神經(jīng)肽和激素等作為免疫遞質(zhì)。因此，神經(jīng)免疫遞質(zhì)、內(nèi)分泌激素和細(xì)胞因子作為信息聯(lián)系的關(guān)鍵因素，越來越受到關(guān)注。HHD多采用口服西藥治療，但是大多均為合成藥，毒副作用較大，而中醫(yī)藥強(qiáng)調(diào)治病求本，減少并發(fā)癥，并且毒副作用較輕，因此被廣泛被用來治療HHD。丹參提取物是從丹參根或根莖中獲得，其味苦，性微寒，是常用中藥，藥理作用為能夠擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)，提高心肌組織攝氧能力，利于改善心肌功能等。研究發(fā)現(xiàn)丹參提取物可逆轉(zhuǎn)高血壓導(dǎo)致的心室重構(gòu)，改善冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病患者左心室功能作用[6]。本研究通過對(duì)對(duì)照組、A、B、C、D組HHD大鼠血壓指標(biāo)和心功能指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，A、B、C和D組均顯著改善，且與A組比較，B、C、D組均顯著改善(P<0.05)，且隨丹參提取物濃度升高，療效越好，說明丹參提取物對(duì)HHD大鼠血壓和心功能有改善作用。史國娟等[7]丹參提取物丹參酮治療大鼠高血壓發(fā)現(xiàn)，丹參能夠通過改善高血壓患者血小板活化功能和血液流變來降低血壓，并對(duì)神經(jīng)活動(dòng)有影響。因此，丹參乙醇提取物對(duì)HHD有療效，能夠降低血壓和改善心臟功能。

SP是神經(jīng)調(diào)節(jié)中信息傳遞的重要活性物質(zhì)，直接調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)，能引起冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張，低濃度引起動(dòng)脈痙攣，研究發(fā)現(xiàn)急性心肌缺血再灌注大鼠體內(nèi)SP含量顯著低于正常大鼠水平[8]。VIP是最常見的肽類神經(jīng)遞質(zhì)之一，對(duì)心肌和血管有調(diào)節(jié)作用，如擴(kuò)張血管、降低血壓、加快心率和增強(qiáng)心肌收縮力等作用[9]。NE對(duì)血管有收縮作用，同時(shí)促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，AngⅡ通過直接收縮血管導(dǎo)致血壓升高，同時(shí)引起心血管系統(tǒng)重建而導(dǎo)致心肌肥大、心肌纖維化等[10]。本研究通過對(duì)對(duì)照組、A、B、C、D組神經(jīng)因子SP、VIP、NE、AngⅡ水平檢測發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，A、B、C和D組SP、VIP均顯著升高(P<0.05)，NE、AngⅡ均顯著降低(P<0.05)，與A組比較，B、C、D組SP、VIP均顯著升高(P<0.05)，NE、AngⅡ均顯著降低(P<0.05)，且D組效果最好，說明丹參提取物能夠影響SP、VIP、NE、AngⅡ水平。丹參可抑制血管平滑肌細(xì)胞合成，阻止心肌成纖維生成，降低氧自由基損害，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而保護(hù)心功能，同時(shí)能夠擴(kuò)張血管，降低外周阻力，改善心肌缺血。心臟神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用主要與心臟神經(jīng)遞質(zhì)的釋放有關(guān)，SP、VIP、NE、AngⅡ均屬相關(guān)因子[11]，因此推測丹參乙醇提取物通過局部SP、VIP來提高心臟壁神經(jīng)元興奮性，并通過抑制NE、AngⅡ水平，促進(jìn)心肌運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而達(dá)到改善心功能和降低血壓的目的。但丹參如何影響神經(jīng)因子SP、VIP、NE、AngⅡ水平具體機(jī)制尚未明確。

本研究通過對(duì)對(duì)照組、A、B、C、D組炎癥反應(yīng)因子IL-10、TNF-α、NK、CD4+/CD8+檢測發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，A、B、C和D組炎性因子TNF-α顯著降低(P<0.05)，IL-10、NK、CD4+/CD8+均顯著升高(P<0.05)，與A組比較，B、C、D組炎性因子TNF-α顯著降低(P<0.05)，IL-10、NK、CD4+/CD8+均顯著升高(P<0.05)，且D組效果最好，說明丹參提取物能影響炎性因子IL-10、TNF-α水平和NK、CD4+/CD8+活性。趙滿等[12]對(duì)丹參滴丸聯(lián)合瑞舒伐他汀治療急性心肌梗死的效果研究，發(fā)現(xiàn)與瑞舒伐他汀對(duì)照組相比，TNF-α水平均顯著降低，IL-10水平顯著改善，說明丹參對(duì)炎癥免疫因子有一定的影響作用。研究認(rèn)為與心功能有關(guān)的細(xì)胞因子可以作為炎癥介導(dǎo)的細(xì)胞因子如促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1等和免疫調(diào)節(jié)抗炎因子IL-10等，心功能發(fā)生障礙時(shí)此類炎癥因子表達(dá)水平升高[13，14]。NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞亞群是在免疫平衡發(fā)揮作用，CD4+/CD8+比例表示機(jī)體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定性，比值升高，表示免疫亢進(jìn)[15]。丹參具有調(diào)節(jié)免疫力，改善身體功能的作用，本研究發(fā)現(xiàn)丹參提取物能有效降低炎性因子水平，而抗炎因子和免疫能力升高，所以推測丹參可能通過改善血管內(nèi)皮功能，擴(kuò)張血管，降低炎癥因子TNF-α水平，增加抗炎因子IL-10和NK、CD4+/CD8+免疫活性，進(jìn)而降低血壓和改善心臟功能。

綜上所述，通過本研究發(fā)現(xiàn)丹參提取物對(duì)HHD大鼠有改善心臟功能和降低血壓作用，推測很可能是通過降低神經(jīng)因子NE、AngⅡ水平和免疫因子TNF-α水平，提高SP、VIP、IL-10因子水平和NK、CD4+/CD8+免疫活性發(fā)揮作用。另外本實(shí)驗(yàn)未對(duì)丹參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和神經(jīng)免疫相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)機(jī)制深入研究，可作下一步探討。