林新鎏，鄭振宇，任 霞，楊朝崴，蘇 鐘，李 靖

1 過敏性疾病患病率流行趨勢

1.1 過敏性疾病全國流行趨勢

在過去30年里，哮喘等過敏性疾病的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢[1]。中國哮喘和過敏的患病率也逐年增長，廣州呼吸健康研究院于1994年至2010年采用ISAAC問卷調(diào)查方案，發(fā)現(xiàn)廣州市兒童哮喘和過敏性鼻炎患病率從1994年的3.9%和17.4%上升到2001年的4.6%和22.4%，再上升至2009年的6.9%和25.1%[2]。1990年、2000年、2010年開展的全國內(nèi)陸城市兒童哮喘流行病學研究也顯示，一些大城市的哮喘患病率持續(xù)上升，例如北京地區(qū)兒童的患病率分別為0.77%、2.05%和2.55%，上海地區(qū)的患病率分別為1.50%、3.34%和5.73%[3-5]。

1.2 過敏性疾病城鄉(xiāng)發(fā)病率差異

與經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)過敏性疾病患病率顯著升高不同，在部分缺乏城市化進程的環(huán)境下人群患病率較低。已報道的兩種典型的保護性環(huán)境包括，歐洲農(nóng)場環(huán)境和農(nóng)村環(huán)境，這兩種環(huán)境下人群患病率保持較低的患病率[6-7]。Stein等[8]比較各30 例匹配的分別來自傳統(tǒng)農(nóng)場環(huán)境的Amish兒童和現(xiàn)代化農(nóng)場環(huán)境的Hutterite 兒童，雖然兩者有著相似的遺傳背景和生活方式，但Hutterite人群的哮喘和過敏性疾病患病率分別是Amish人群的4倍和6倍，而Amish家居灰塵中的內(nèi)毒素水平卻是后者的6.8倍。課題組對廣州市區(qū)和從化農(nóng)村的13～14歲兒童過敏性疾病進行對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)農(nóng)村兒童的哮喘患病率顯著低于城市兒童(3.4%vs. 6.9%)，過敏性鼻炎和濕疹患病率也發(fā)現(xiàn)相似的城鄉(xiāng)差異[9]。與中國南方地區(qū)類似，北京周邊農(nóng)村地區(qū)兒童哮喘患病率亦顯著低于北京市區(qū)兒童(1.1%vs. 6.3%)[6]。

西方發(fā)達國家的食物過敏患病率持續(xù)升高，但地區(qū)間差異顯著。最近一項薈萃分析顯示，歐洲17歲以下兒童自我報告的食物過敏患病率為6.9%；當結(jié)合sIgE陽性結(jié)果時，患病率降至3.6%[10]。亞洲地區(qū)兒童和西方國家的食物過敏患病率差異很大。在泰國北部地區(qū)，家長自我報告的食物過敏患病率為9.3%，通過食物激發(fā)試驗明確的患病率為1.1%[11]。課題組采用歐洲Europrevall-INCO標準化問卷，對廣州城市和韶關(guān)農(nóng)村5～15歲學齡兒童進行橫斷面調(diào)查研究，結(jié)果兩地自我報告的食物過敏(3.7%)和IgE介導的食物過敏(0.3%)的患病率均很低，且城鄉(xiāng)之間沒有顯著性差異(0.36%vs. 0.30%，P=0.586)。而最近Botha等[12]首次對由食物激發(fā)試驗診斷的食物過敏進行城鄉(xiāng)比較，顯示南非農(nóng)村人口的食物過敏患病率和致敏率都比較低。這提示食物過敏在亞洲的模式特征可能有別于西方國家，還需要進一步探討。

2 過敏原致敏情況

2.1 吸入性過敏原

塵螨是中國南方地區(qū)最常見的吸入性過敏原。其他常見的吸入過敏原包括蟑螂、貓毛和狗毛等。國內(nèi)研究顯示，分別有59.0%、57.6%和40.7%的過敏患者對粉塵螨(Der-f)、屋塵螨(Der-p)以及熱帶螨過敏[13]。課題組的數(shù)據(jù)顯示，Der-f、Der-p致敏兒童的喘息患病率分別從2001年的14.4%、15.3%上升到2009年的30.9%、33.1%。同時，對塵螨致敏兒童的喘息患病率顯著高于非致敏兒童[2]。2002年廣州兒童對Der-p、Der-f、貓毛和混合草花粉等過敏原的致敏率分別為41.7%、42.7%、4.7%和0.5%，到2010年顯著增加(分別為55.0%、55.0%、17.1%和3.7%)。與此相反，蟑螂致敏率從2002年的16.0%下降到2010年的7.6%[2]。筆者一項針對中國鼻炎伴或不伴哮喘患者的多中心研究顯示，美洲大蠊和德國小蠊的致敏率分別為26.34%和19.37%，盡管致敏患者對蟑螂暴露的皮膚反應(yīng)較輕，但蟑螂的致敏性與哮喘的患病率之間存在顯著相關(guān)性[14]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，韶關(guān)農(nóng)村地區(qū)蟑螂過敏原致敏率顯著高于廣州城市[15]。我國北方地區(qū)，Wang等[16]調(diào)查內(nèi)蒙古地區(qū)過敏性鼻炎患病率為32.4%，其中半數(shù)以上為花粉癥相關(guān)過敏性鼻炎，其患病率高達18.5%。

2.2 食物過敏原

大量的研究數(shù)據(jù)顯示，食物過敏非常常見，其患病率呈上升趨勢，且存在地域差異。國內(nèi)重慶地區(qū)有一單中心橫斷面兒童食物過敏的報道，從1999年到2009年，食物過敏患病率從3.5%上升到了7.7%[17]。本課題組在城鄉(xiāng)食物過敏研究的后續(xù)病例對照研究中發(fā)現(xiàn)，韶關(guān)農(nóng)村兒童皮膚點刺試驗(30.2%vs. 9.7%)與血清sIgE(48.8%vs. 31.0%)檢出的食物過敏原陽性率(致敏率)均顯著高于廣州市區(qū)。進食蝦、蟹是導致廣州和韶關(guān)地區(qū)學齡兒童食物過敏的主要原因。但農(nóng)村兒童的食物過敏患病率很低，兩者之間存在分離，其原因仍需要進一步的研究驗證。

3 危險因素及微生物暴露

3.1 過敏性疾病危險因素

哮喘發(fā)病機制為多因素性，其發(fā)病危險因素中最重要的是遺傳和環(huán)境因素，由于遺傳背景不可能在短短數(shù)十年內(nèi)發(fā)生顯著變化，所以環(huán)境因素可能是該病的決定因素。1989年，Strachan[18]首次提出衛(wèi)生假說，認為人類過敏性疾病和自身免疫疾病的迅速上升要歸因于太過干凈的環(huán)境，但環(huán)境中起重要作用的暴露因子尚不清楚。在隨后近30年間，國際多個團隊對兒童哮喘患病率與環(huán)境暴露因素進行相關(guān)分析并探討可能的分子機制[19]。Braun-Fahrlander等[20]在1999年首次發(fā)現(xiàn)農(nóng)場長大的兒童發(fā)展為過敏體質(zhì)及過敏性疾病的概率顯著低于非農(nóng)場兒童。隨后多項系列研究,包括歐洲農(nóng)場環(huán)境[21-23]、美國Amish傳統(tǒng)農(nóng)場及Hutterite現(xiàn)代農(nóng)場環(huán)境[8]及城市和農(nóng)村的對比研究[9,24-26]，均驗證了農(nóng)場環(huán)境的保護作用，稱為“農(nóng)場效應(yīng)”[27]。三種環(huán)境的共性表現(xiàn)是，生命早期暴露于農(nóng)場環(huán)境(尤其是傳統(tǒng)農(nóng)場)或農(nóng)村環(huán)境的人群，過敏性疾病的患病率顯著低于缺乏相關(guān)保護性暴露因子的人群。由于環(huán)境的多樣性，不同研究發(fā)現(xiàn)的保護性環(huán)境因子并不完全相同，可能的因子包括接觸農(nóng)場牲畜、農(nóng)作物[21]、未消毒牛奶[28-30]、母乳喂養(yǎng)[26]、農(nóng)場或農(nóng)村耕種活動[9,31]等。

在ISAAC國際多中心研究框架下，通過使用標準化的流行病學調(diào)查問卷，本課題組系列研究[9]及首都兒科研究所[6]等相關(guān)研究均確認了中國南方和北方農(nóng)村環(huán)境的保護作用。本課題組對廣東省的廣州市區(qū)和從化農(nóng)村的調(diào)查研究，顯示農(nóng)村的種植環(huán)境和家居粉塵的內(nèi)毒素水平成為從化兒童哮喘發(fā)病的保護因素[9]。而Kim等[32]則發(fā)現(xiàn)，中國部分農(nóng)村人群存在低過敏性疾病患病率但高過敏體質(zhì)的分離現(xiàn)象，其原因尚不清楚，部分原因可能在于過敏原的交叉反應(yīng)性，例如中國南方農(nóng)村蝦致敏兒童可能是由蟑螂過敏造成[33]。

3.2 微生物組分、種類及多樣性

內(nèi)毒素及微生物暴露可能是不同環(huán)境暴露作用的共有關(guān)鍵因子之一。農(nóng)場及農(nóng)村環(huán)境存在高水平內(nèi)毒素暴露，其與低過敏性疾病患病率相關(guān)[34-36]。2015年，發(fā)表在Science雜志的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素的保護作用可能與誘導肺上皮細胞中A20表達上調(diào)有關(guān)[37]。2016年，NEnglJMed雜志發(fā)表的一項研究發(fā)現(xiàn)，Amish傳統(tǒng)農(nóng)場內(nèi)毒素含量是Hutterite現(xiàn)代農(nóng)場的6.8倍，可調(diào)節(jié)兒童固有免疫通路進而預防過敏性疾病的發(fā)生。除內(nèi)毒素的調(diào)節(jié)作用外，多種微生物相關(guān)模式識別分子(PAMP)，包括胞外多糖(extracellular polysaccharides，EPS)、胞壁酸(muramic acid)、β-葡聚糖(glucans)等與農(nóng)場保護效應(yīng)密切相關(guān)[38]。此外，Debarry 等[39]從農(nóng)場環(huán)境中篩選出兩種細菌(Acinetobacter lwoffii與Lactococcus lactis)可誘導Th1細胞分化，介導過敏保護作用。Ege 等[40]首次報道屋塵中細菌和真菌多樣性與暴露兒童哮喘發(fā)病率顯著負相關(guān)，為環(huán)境保護效應(yīng)提出新假說。

4 環(huán)境因素與過敏性疾病免疫學調(diào)控

過敏性疾病患病率的急劇增加與環(huán)境變化之間的關(guān)系尚認識不足，但通常認為和衛(wèi)生假說有關(guān)[18]。近年來已逐漸明確過敏性疾病作為一種異質(zhì)性疾病，具有不同致病機制，固有免疫及獲得性免疫均參與其中。誘發(fā)因素包括過敏原暴露、微生物感染、氧化應(yīng)激誘導，涉及的細胞包括嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、Th2細胞、樹突狀細胞(DC)、中性粒細胞、NKT細胞、自然輔助細胞、上皮細胞、Th17細胞和巨噬細胞等[41]。

4.1 固有免疫機制

人類進化過程中，伴隨著與周圍病原體相互作用或共生，如某些腸道和呼吸道菌群與寄生蟲等廣泛存在病原相關(guān)分子模式(PAMP)，可通過結(jié)合宿主DC等固有免疫細胞表達的多種模式識別受體(PRR)，如Toll樣受體(TLR)，從而產(chǎn)生免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)場暴露兒童與非暴露兒童相比，其CD14/TLR2表達水平升高，表明生命早期農(nóng)場環(huán)境暴露通過TLR受體等通路對過敏性疾病起重要調(diào)控作用[42]。隨后的研究表明，母親產(chǎn)前暴露在富含微生物環(huán)境中能使后代TLR2/TLR4/CD14固有免疫系統(tǒng)受體上調(diào)，其機制可能與宮內(nèi)環(huán)境或表觀遺傳改變有關(guān)，有待進一步闡明[43]。TLRs被認為是免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的關(guān)鍵系統(tǒng)，上皮細胞和DC在連接先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用。早期暴露于內(nèi)毒素(LPS)會減弱產(chǎn)生過敏性細胞因子所需信號通路，但會保留dsRNA/DCs通路，從而激活DCs產(chǎn)生更多Th1細胞因子。此外，LPS暴露增加鋅脂蛋白A20合成[44]，從而抑制氣道上皮對屋塵螨的過敏反應(yīng)[45]。一項前瞻性研究表明，母親產(chǎn)前接觸農(nóng)場動物，其后代臍帶血TLR5、TLR9明顯升高，且特應(yīng)性皮炎患病風險明顯下降[46]。如前述及Stein等[8]比較各30 例Amish 兒童和Hutterite 兒童外周血白細胞的組成和表型，結(jié)果Amish兒童嗜酸性粒細胞比例降低，單核細胞表現(xiàn)出抑制表型(HLA-DR低水平、ILT3高水平)。且Amish灰塵提取物對哮喘動物模型有明顯保護作用，在缺乏MyD88的小鼠中，此保護作用急劇下降，而在缺乏MyD88和TRIF的小鼠，此保護作用被完全廢除，而這兩種分子位于多條固有免疫信號通路的匯聚點，因此，提示農(nóng)場環(huán)境通過固有免疫發(fā)揮對過敏性疾病的保護作用。

目前已知，環(huán)境中除內(nèi)毒素外，尚有大量其他類型微生物產(chǎn)物，它們共同組成固有免疫系統(tǒng)的有效刺激物[47-48]。iNKT細胞能識別糖脂類抗原，部分PAMP可不經(jīng)TLR直接激活iNKT細胞。屋塵提取物(HDE)能通過iNKT細胞，促進OVA誘導哮喘小鼠氣道炎癥，但尚未找到HDE中iNKT相關(guān)抗原來源[49]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)乳鼠感染甲流可以保護成年鼠免受過敏原誘導AHR，這與肺內(nèi)DN CD38亞群在NKT細胞優(yōu)勢擴展有關(guān)，并首次提出富集的DN、T-bet-依賴性、分泌γ-干擾素的NKT細胞亞群能強有力地抑制AHR的發(fā)展[50]。2019年，有學者提出早期/新生兒期感染或抗原刺激可通過肺部NKT細胞的某些亞群如CD38hiDN NKT細胞，產(chǎn)生IFN-γ，而非IL-17、IL-4或IL-13，并且首次證明這些亞群能直接接觸抑制CD4+T細胞增殖，從而阻止過敏原誘導的AHR[51]?？傊甆KT細胞不同亞群在過敏性疾病中通過不同機制，執(zhí)行不同功能，值得進一步深入研究。

4.2 獲得性免疫機制

2000年，Gereda等[52]在Lancet發(fā)表的研究提供直接證據(jù)，表明持續(xù)環(huán)境內(nèi)毒素暴露能誘導Th1型免疫反應(yīng)，從而降低對過敏原的敏感度，并促進T細胞向Th1細胞分化，使Th1/Th2平衡，保護嬰兒免受過敏原致敏。

Treg細胞在過敏性疾病發(fā)病機制中的致敏階段發(fā)揮核心作用，在平衡T細胞分化和成熟過程中發(fā)揮重要功能。所有的Th細胞，包括Th1、Th2、Th17細胞的功能受Treg調(diào)節(jié)，在過敏性疾病的免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用[53]。隨著近年來對Treg細胞研究進展，越來越多關(guān)于環(huán)境微生物等暴露與Treg分化發(fā)育的相關(guān)性被報道。McGuirk等[54]和Wilson[55]分別報道了細菌等病原體和線蟲感染有利于Treg細胞的發(fā)育。2009年Schaub等[56]研究發(fā)現(xiàn)，母親農(nóng)場暴露可以調(diào)節(jié)后代的免疫系統(tǒng)，新生兒臍帶血Treg數(shù)量和功能提高，Th2相關(guān)淋巴細胞增殖減少，Th2細胞因子下降。此外，攝入農(nóng)場牛奶的母親，其后代FOXP3去甲基化增加。并且在農(nóng)場暴露母親的后代，兒童期及成年期過敏性疾病風險下降。2015年Lluis等[57]報道，在4.5歲兒童中，農(nóng)場牛乳暴露通過Treg細胞數(shù)量增加、誘導調(diào)節(jié)表型起保護作用。

5 小鼠動物模型與過敏性哮喘

利用動物模型研究過敏性哮喘的免疫學機制、尋求新的防治手段具有重要意義。近年來，多項動物實驗表明，病原微生物感染，甚至暴露于滅活致病微生物或其中某些單一成分，都能對過敏性疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生深遠影響[58]。建立反應(yīng)不同保護性環(huán)境暴露的小鼠模型對于探討保護性環(huán)境因子及其分子調(diào)控機制具有重要價值。

5.1 過敏性哮喘研究中常用小鼠模型

誘導小鼠過敏性哮喘一般包括致敏和激發(fā)兩個階段：先以特定過敏原使小鼠全身致敏，后續(xù)以相同的過敏原進行氣道激發(fā)。多數(shù)研究使用卵白蛋白OVA作為過敏原進行致敏和激發(fā)，少數(shù)用屋塵螨[59]。激發(fā)后，48 h內(nèi)，將小鼠暴露在濃度逐漸增加的乙酰甲膽堿中，測定小鼠氣道阻力的變化[60]。

5.2 小鼠屋塵暴露模型與過敏性哮喘

由于兒童每天有較長時間在臥室度過，其臥室屋塵可在一定程度上反應(yīng)環(huán)境暴露情況。利用不同來源屋塵提取物，建立低劑量持續(xù)暴露的小鼠模型，可反應(yīng)環(huán)境暴露對小鼠的綜合免疫調(diào)節(jié)作用。該模型比單純使用內(nèi)毒素等單體的模型更能反應(yīng)環(huán)境暴露的綜合作用。屋塵暴露的來源大致可分為城市和農(nóng)村兩種。類型可包括牛棚、馬棚、雞舍灰塵，以及有否動物暴露的家居屋塵等。屋塵暴露途徑包括滴鼻和壓縮泵霧化。多項研究表明，每日持續(xù)低劑量暴露可減輕氣道炎癥，而每周大劑量暴露可加重氣道炎癥[61-62]。

5.3 寄生蟲感染模型與過敏性哮喘

寄生蟲感染小鼠模型在過敏性疾病研究中已有大量報道。在曼氏血吸蟲感染的小鼠模型中，母鼠在感染的Th1期或調(diào)節(jié)階段交配，后代小鼠對OVA激發(fā)的氣道反應(yīng)顯著降低[63-64]。寄生蟲可通過分泌免疫調(diào)節(jié)分子調(diào)控免疫系統(tǒng)。例如Severine等已經(jīng)鑒定了鉤蟲、鞭蟲等可分別分泌AIP-2、P43，AIP-2通過抑制DCs上的共刺激表達及室內(nèi)塵螨過敏患者T細胞的體外增殖，P43通過結(jié)合IL-13，抑制Th2應(yīng)答[65-66]。然而并非所有寄生蟲感染都具有保護作用，通常發(fā)生在生命早期和一些慢性感染具有保護作用；而低負擔群體和一些偶發(fā)性急性感染會增強過敏反應(yīng)[67]。

本課題組建立了小鼠腸道多形螺旋線蟲感染模型，該模型可產(chǎn)生較強的Th2型免疫反應(yīng)，并跨器官對肺臟炎癥進行免疫調(diào)節(jié)。筆者發(fā)現(xiàn)，IL-10+Breg細胞通過細胞-細胞直接接觸，顯著促進CD4+T細胞向IL-10+Treg細胞方向增殖分化，從而抑制氣道過敏性炎癥[68]。

5.4 小鼠腸道菌群與過敏性哮喘

無菌小鼠缺乏腸道菌群，與傳統(tǒng)小鼠相比其腸道基因表達、免疫系統(tǒng)發(fā)育不同[69]。無菌小鼠對變應(yīng)原引起的氣道疾病表現(xiàn)出更高的易感性，涉及不同機制，如IgE的增加和黏膜上嗜堿性粒細胞數(shù)量的增加等[70-71]。一些研究表明腸道寄生蟲和菌群之間可能存在相互作用，因為它們都生活在同一個器官中，例如，人體寄生蟲感染與菌群多樣性的增加有關(guān)[72-73]。腸道菌群與疾病的關(guān)系是目前多個領(lǐng)域的研究熱點，但寄生蟲在其中是否存在重要的作用仍了解甚少，闡明寄生蟲感染與腸道菌群互相協(xié)作調(diào)控過敏性疾病的分子機制是未來研究方向之一。

6 小結(jié)

過敏性疾病患病率在全球的上升趨勢給社會增加了越來越多的醫(yī)療支出。歐洲農(nóng)場及我國農(nóng)村地區(qū)的保護性環(huán)境對于加深過敏性疾病的預防及調(diào)控機制提供了重要的對比研究模型。結(jié)合流行病學調(diào)查研究以及小鼠模型，深入探討環(huán)境暴露因子對過敏性疾病的調(diào)控作用，有助于彌補對過敏性疾病發(fā)病分子機制的知識缺口，有助于開發(fā)新的防控措施。衛(wèi)生假說提出已有30年，且在不斷完善之中。結(jié)合目前本領(lǐng)域的研究熱點，本文為后續(xù)研究方向提供新的思路。