姚 磊 ，陳昊 ，孫樹(shù)坤 ，楊秋萍 **

（ 1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150028； 2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，哈爾濱 150028）

我國(guó)是世界上主要的大豆生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)[1]，據(jù)美國(guó)大豆協(xié)會(huì)（Soy-base.org)統(tǒng)計(jì)表明，2017/2018年度，中國(guó)大豆年產(chǎn)量約1 500萬(wàn)t，進(jìn)口約9 500多萬(wàn)t，總消費(fèi)量達(dá)到11 000萬(wàn)t，主要用于油料和大豆蛋白制品加工[2]。大豆豆渣（簡(jiǎn)稱豆渣）是大豆加工產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物[3]，含有豐富的粗纖維（Soybean crude fiber，SCF），約占 60%～70%，由于其水溶性低、口味差和不耐貯藏等缺陷，一般都作為飼料或廢棄物處理[4]，不僅浪費(fèi)大量的可利用資源，且容易造成環(huán)境污染[5]。

多糖（Polysaccharide）是由10個(gè)以上的單糖以糖苷鍵相連而成的聚合物，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，是生命體重要的組成成分，與多項(xiàng)生命活動(dòng)密切相關(guān)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有抗氧化[7-8]、抗輻射[9-10]、抑制腫瘤[11]、免疫調(diào)節(jié)[12-13]和降血糖[14]等多種生理活性[15-16]和功能。有關(guān)大豆水溶性多糖的提取工藝[17-19]及其應(yīng)用[20-22]已經(jīng)有了一定的研究報(bào)道，但對(duì)其非水溶性多糖部位精深開(kāi)發(fā)利用的報(bào)道較少。

以豆渣為原料，制備得到大豆粗纖維（Soy?bean crude fiber，SCF），繼而以SCF作為底物，采用纖維素酶進(jìn)行降解制備具有生物活性的水溶性多糖（Polysaccharides from soybean residue，SRP），對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)抗氧化活性跟蹤，確定最佳抗氧化多糖片段SRP，為進(jìn)一步研究大豆抗氧化多糖在體內(nèi)對(duì)氧化損傷的防護(hù)功效提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為大豆副產(chǎn)品的精深加工利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆渣，實(shí)驗(yàn)室自制；氫氧化鉀，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；硫酸（98%），天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；鹽酸（36%），哈爾濱市新春化工廠；纖維素酶AccelleraseTM1000，無(wú)錫杰能科生物工程有限公司；過(guò)氧化氫、水楊酸、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵和三氯化鐵，天津市科密歐化學(xué)試劑制造有限公司；ABTS，美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋HWS24，上海一恒科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-1002-VN，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；pH計(jì)PB-10，德國(guó)Sartorius；電子分析天平R200D，德國(guó)Sartorius；離心機(jī)JDZ5-2，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大豆粗纖維制備

豆渣經(jīng)去除脂肪、淀粉和蛋白等成分，所得參與固體成分經(jīng)洗滌，干燥后即得大豆粗纖維（SCF）。將豆渣經(jīng)石油醚（30～60℃）提取劑回流，去除豆渣中的脂肪類物質(zhì)，之后于1.25%H2SO4微沸60min，水洗至中性，再經(jīng)1.25%KOH微沸60min，水洗至中性，過(guò)濾，所得的殘?jiān)?jīng)低溫真空干燥后即為大豆纖維多糖制備底物SCF。以此法制備SCF，得率為68.30%，按GB/T 5009.10-2003定粗纖維含量為93.25%。

1.3.2 酶解工藝單因素條件優(yōu)化

（1）SRP得率計(jì)算

準(zhǔn)確稱取一定量SCF，經(jīng)纖維素酶水解后固液分離，制得水溶性多糖SRP分布于上清液中，殘?jiān)娓珊蠓Q重，按式1計(jì)算SRP得率：

式中：W0為降解前SCF質(zhì)量；Wi為降解后SCF殘?jiān)|(zhì)量。

（2）酶用量對(duì)SRP得率的影響

分別稱取5份5.00 g SCF，移入250 mL三角瓶中，加入濃度0.1 mol/L，pH 5.0的醋酸鈉緩沖溶液100 mL，制成5%纖維懸液，然后分別按20 U/g、40 U/g、60 U/g、80 U/g、100 U/g加入纖維素酶液，50℃降解1 h后，沸水浴加熱10 min，測(cè)定SRP得率。

（3）pH對(duì)SRP得率的影響

分別稱取5份5.00 g SCF，移入250 mL三角瓶中，分別加入濃度0.1 mol/L，pH 4.0、4.5、5.0、5.5和6.0的醋酸鈉緩沖溶液100 mL，制成纖維懸液，然后按20 U/g加入纖維素酶液，50℃降解1 h后，沸水浴加熱10 min，測(cè)定SRP得率。

（4）溫度對(duì)SRP得率的影響

分別稱取5份5.00 g SCF，移入250 mL三角瓶中，加入濃度0.1 mol/L，pH 5.0的醋酸鈉緩沖溶液100 mL，按20 U/g加入纖維素酶液，分別于30℃、40℃、50℃、60℃和70℃下，降解1 h后，沸水浴加熱10 min，測(cè)定SRP得率。

1.3.3 SCF酶解工藝響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)確定的SCF最佳降解酶用量、pH和溫度為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化SRP制備工藝。各因素編碼水平見(jiàn)表1。

利用Design expert V8.0.6軟件對(duì)SRP制備條件優(yōu)化的3因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，降解結(jié)束后將降解液以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，收集上清液，計(jì)算各組實(shí)驗(yàn)條件下SRP得率，比較制備效果并進(jìn)行分析。

1.3.4 最佳抗氧化活性大豆多糖片段的篩選

SRP酶法制備最優(yōu)工藝參數(shù)下，將纖維酶解不同時(shí)段，所得產(chǎn)物經(jīng)總還原力測(cè)定，ABTS自由基和羥基自由基清除能力實(shí)驗(yàn)，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行比較，確定最佳抗氧化活性片段。

（1）羥基自由基的清除

參考Li[23]等的方法，在測(cè)定管中依次加入1 mL不同濃度樣品溶液，水楊酸（9 mmol/L）1 mL，硫酸亞鐵（9 mmol/L）1 mL，最后加入1 mL過(guò)氧化氫（8.8 mmol/L），漩渦振蕩混勻，啟動(dòng)反應(yīng)。在37℃水浴30 min，反應(yīng)結(jié)束后，在510 nm處測(cè)定吸光度Ai，對(duì)照管中以等體積蒸餾水代替過(guò)氧化氫測(cè)定吸光度Ai0，標(biāo)準(zhǔn)管中以等體積蒸餾水代替樣品測(cè)定吸光度A0。羥自由基清除能力按式2計(jì)算：

（2）總還原力測(cè)定

測(cè)定采用普魯士藍(lán)法[24]，操作參考王博等[25]的方法，25 mL具塞比色管中，分別加入不同濃度（10～120 μg/mL）SRP溶液、PBS緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.6）、1%鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]液各2.5 mL，混合均勻后于50℃水浴中保持20 min。反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻，加入2.5mL10%三氯乙酸（TCA），以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液2.5 mL于試管中，分別加入2.5mL蒸餾水，0.1%的三氯化鐵溶液0.5mL，充分混勻，靜置反應(yīng)10 min，測(cè)定700 nm波長(zhǎng)處的吸光值A(chǔ)i，以蒸餾水代替不同濃度SRP，同法操作測(cè)定吸光度值A(chǔ)0。以反應(yīng)體系吸光度值（Ai-A0）來(lái)評(píng)價(jià)SRP的總還原能力，吸光值越大表示其還原力越強(qiáng)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及變量水平

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)中測(cè)定結(jié)果做3次重復(fù)，每次做3個(gè)平行。最后結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差（means±SD）表示。結(jié)果采用SPSS（Version 22.0）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRP制備單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶用量對(duì)SRP得率的影響

由圖1可知，在pH 5.0、溫度50℃條件下，考察酶用量對(duì)SRP得率的影響。在酶用量20～60 U/g，隨著酶用量的增加，SRP得率增加趨勢(shì)明顯。超過(guò)60 U/g以后，繼續(xù)增加酶用量，SRP得率基本不再變化。由于底物濃度是固定的，隨著酶用量的增加，酶底比逐漸增加，因此反應(yīng)速率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，當(dāng)酶用量達(dá)到60 U/g后，酶在纖維表面的分散達(dá)到飽和狀態(tài)，此時(shí)繼續(xù)增加酶用量，SRP得率并無(wú)明顯增加。

纖維素酶的用量是直接決定纖維降解成本的最重要因素之一[26]，因此在滿足一定降解效率的情況下，盡量選擇最低的酶用量?？紤]酶用量40 U/g組與60 U/g組間差異無(wú)顯著性（P＞0.05），故選擇40 U/g為降解制備SRP單因素的最佳酶用量。

圖1 酶用量對(duì)SRP得率的影響

2.1.2 pH對(duì)SRP得率的影響

pH對(duì)SRP得率的影響如圖2所示。溫度50℃，降解時(shí)間1 h，在pH 3.5～5.0，隨著pH的增加，得率逐漸上升，至pH 4.5時(shí)SRP得率為41.66%，pH 5.0時(shí)達(dá)到最大值44.25%。此后隨著pH繼續(xù)增加，SRP得率表現(xiàn)出持續(xù)下降趨勢(shì)。

圖2 pH值對(duì)SRP得率的影響

纖維素酶降解是固液反應(yīng)，是水溶性的纖維素酶與粗纖維結(jié)合產(chǎn)生的一系列生化反應(yīng)過(guò)程。纖維素酶先要吸附在底物上，所以說(shuō)纖維素與纖維素酶的接觸性是酶解反應(yīng)的關(guān)鍵因素。詹小明等[27]利用玉米芯為纖維底物，進(jìn)行纖維素酶降解研究發(fā)現(xiàn)，pH 4.8時(shí)，外切型β-葡聚糖酶（C1酶）、內(nèi)切型β-葡聚糖酶（CMC酶）能大部分穩(wěn)定地吸附到玉米芯上，而纖維二糖酶（CB酶）主要游離在酶解液中，當(dāng)pH升高或降低時(shí)，纖維素酶吸附率尤其C1酶的吸附率明顯下降，不利于纖維素酶的吸附和降解反應(yīng)的進(jìn)行。因此，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定SRP降解最適pH為5.0。

2.1.3 溫度對(duì)SRP得率的影響

溫度對(duì)SRP制備效果的影響如圖3所示。在30～50℃，隨著溫度的升高，SRP得率明顯增加，溫度為50℃時(shí)，SRP得率達(dá)到最大值44.67%。溫度55℃時(shí)SRP得率略有下降，60℃時(shí)SRP得率出現(xiàn)更明顯下降。鄭曉燕等在香蕉皮不溶性纖維酶法降解特性研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的趨勢(shì)[28]。

圖3 溫度對(duì)SRP得率的影響

通常溫度的升高可以增加反應(yīng)物分子活化能，起到促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行的作用，有利于增加SRP得率，在30～50℃較好的體現(xiàn)了這一趨勢(shì)。但是在溫度高于50℃時(shí)，SRP得率并未隨溫度的增加而繼續(xù)增加，甚至在較高溫度下出現(xiàn)明顯下降。這是因?yàn)?，酶促反?yīng)速率的最大決定因素應(yīng)該是酶的活性，而酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，在溫度高于50℃時(shí)，酶蛋白開(kāi)始發(fā)生一定程度的變性，帶來(lái)酶分子空間構(gòu)象上的改變，甚至影響活性中心構(gòu)象，使得底物不能與酶發(fā)生很好的誘導(dǎo)契合，因此引起酶促反應(yīng)速率的下降，嚴(yán)重時(shí)甚至可能引起酶失活，導(dǎo)致酶促反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行，由此確定50℃作為SRP最適制備溫度。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化SRP制備工藝

經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)得出固液比、pH、溫度和酶用量的最優(yōu)值分別為：固液比1∶20，pH 5.0，溫度50℃，酶用量40 U/g。經(jīng)分析比較，各影響因素中pH、溫度和酶用量對(duì)SRP得率影響相對(duì)較大，因此在單因素實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法設(shè)計(jì)，對(duì)影響SRP得率的3個(gè)因素pH、溫度和酶用量進(jìn)行中心組合試驗(yàn)。響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)表2中試驗(yàn)結(jié)果回歸擬合所得回歸模型如下：

對(duì)二次多項(xiàng)回歸方程進(jìn)行顯著性驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，模型的一次項(xiàng)X1-酶用量和X2-pH影響系數(shù)極顯著，X3-溫度影響不顯著，交互項(xiàng)X1X3和X2X3系數(shù)顯著，而交互項(xiàng)X1X2的系數(shù)不顯著。

對(duì)二次多項(xiàng)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，相關(guān)系數(shù)R2=0.983 2，響應(yīng)面回歸模型高度顯著（P＜0.000 1），模型失擬項(xiàng)（P≤0.143 8），不顯著，說(shuō)明該二次模型擬合充分，可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面分析優(yōu)化后模型的系數(shù)檢驗(yàn)

表4 響應(yīng)面回歸模型方差分析

圖4、圖5與圖6分別為X1-酶用量、X2-pH和X3-溫度3因素影響SRP得率的響應(yīng)面及等高線分析圖。由圖4可見(jiàn)，在pH 4.5～5.0，X1-酶用量、X2-pH表現(xiàn)為對(duì)SRP得率互惠的交互作用。酶用量一定的情況下，SRP得率隨著pH的增加明顯增加，當(dāng)pH大于5.0后，SRP得率則逐漸下降。由圖5可見(jiàn)，酶用量和溫度在低水平范圍內(nèi)，隨著溫度和酶用量的增加，SRP得率迅速增加，二者表現(xiàn)出明顯的交互作用。溫度在47.5～52.5℃，酶用量30～60 U/g，SRP得率可達(dá)到最高水平。由圖6可見(jiàn)，響應(yīng)曲面的坡度相對(duì)較陡，表明響應(yīng)值（SRP得率）對(duì)溫度和pH的變化敏感。在pH4.5～5.0，SRP得率隨溫度的升高迅速增加，在溫度50℃，pH 5.0附近達(dá)到最高水平。

結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析結(jié)果與響應(yīng)面圖及等高線分析圖確定SRP制備最佳工藝參數(shù)為：酶用量60 U/g、pH 5.10、溫度49.64℃?；貧w模型預(yù)測(cè)的理論降解率可達(dá)到45.73%。實(shí)際制備條件采用酶用量60 U/g、pH 5.10、溫度50℃，重復(fù)3次試驗(yàn)，所得SRP得率分別為：45.58%、45.81%和45.74%，平均得率為45.71%，與理論預(yù)測(cè)值相比相對(duì)誤差為0.44%，可見(jiàn)該模型能較好地模擬和預(yù)測(cè)纖維素酶制備SRP的得率。

圖4 pH值和酶用量交互作用對(duì)SRP得率的影響

圖5 溫度和酶用量交互作用對(duì)SRP得率的影響

2.3 抗氧化活性多糖片段的篩選

多糖的分子量，對(duì)其功能性具有十分重要的影響[29]。酶解時(shí)間對(duì)纖維的酶解產(chǎn)物分子量分布具有很大的影響，隨著酶解時(shí)間的增加，SRP得率呈增加趨勢(shì)，其平均分子量也逐漸下降。在所得酶法制備SRP最優(yōu)工藝參數(shù)下，將SCF酶解2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h不同時(shí)間，得到6組多糖活性片段，對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行總還原力和羥基自由基清除能力實(shí)驗(yàn)，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行比較，確定最佳酶解時(shí)間和最佳活性多糖片段。

圖6 溫度和pH交互作用對(duì)SRP得率的影響

2.3.1 不同多糖片段總還原能力

多糖片段的還原能力是其抗氧化活性的重要指標(biāo)，抗氧化劑給自由基提供電子，將三價(jià)鐵還原成二價(jià)鐵形成普魯士藍(lán)著色復(fù)合體，通過(guò)分析在700 nm波長(zhǎng)下吸光值，吸光度值越高表明多糖還原能力越強(qiáng)[30]。

總還原能力測(cè)定結(jié)果如圖7所示，6種SRP多糖片段的總還原能力均隨著濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，并表現(xiàn)出良好的劑量依賴性。當(dāng)濃度在1～10 mg/mL，6種SRP的總還原能力呈線性明顯增加，此后繼續(xù)增加濃度，吸光值增加趨勢(shì)趨于平緩。當(dāng)濃度為40 mg/mL時(shí)8 h組吸光值最高（0.778），其次為6 h組（0.728）和10 h組（0.692），2 h、4 h和12 h組則都低于0.600。

圖7 不同降解時(shí)段SRP總還原能力

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6種SRP多糖片段表現(xiàn)出較好的總還原能力，從2～8 h，隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，SRP還原能力也逐漸增加，這可能與多糖片段增加，還原端暴露的增加有關(guān)。而降解時(shí)間繼續(xù)增加，所得SRP片段總還原能力則表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，這有可能是降解度的增加，導(dǎo)致SRP組分中不具還原力的單糖相對(duì)含量增加引起總還原力下降的現(xiàn)象。

2.3.2 不同多糖片段對(duì)羥基自由基清除能力

不同降解時(shí)間所得SRP對(duì)羥基自由基清除效果如圖8所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2～12 h降解組分別表現(xiàn)出較強(qiáng)的羥基自由基清除作用，隨著SRP濃度的增加，羥基自由基清除率也增加，表現(xiàn)出良好的劑量依賴性。各組EC50分別為：8 h（3.91 mg/mL）＜6 h（5.18 mg/mL）＜12 h（5.19 mg/mL）＜10 h（7.97 mg/mL）＜ 4 h（16.65 mg/mL）＜2 h（29.74 mg/mL），即降解時(shí)間8 h組所得SRP組分對(duì)羥基自由基有著最強(qiáng)的清除效果。

3 結(jié)論

采用纖維素酶法制備了豆渣纖維多糖，并利用響應(yīng)面分析法進(jìn)行優(yōu)化，得到SRP最佳制備工藝參數(shù)為：酶用量60 U/g、pH 5.10、溫度50℃，在此條件下，酶解1 h所得SRP得率為45.71%。

圖8 SRP對(duì)羥基自由基清除效果

通過(guò)測(cè)定總還原力和清除羥基自由基指標(biāo)評(píng)價(jià)SRP抗氧化活性，結(jié)果顯示降解時(shí)間2～4 h所得SRP片段和10～12 h所得SRP片段抗氧化活性相對(duì)低于降解6～10 h時(shí)段所得SRP片段。其原因可能是降解時(shí)間相對(duì)較短的SRP片段相對(duì)分子量較大，溶解性較差，還原端暴露較少。而降解時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)的SRP片段所含單糖、寡糖組分含量較高，失去多糖的抗氧化特性。而在降解6～10 h SRP片段中，降解時(shí)間8 h所得SRP片段表現(xiàn)出最強(qiáng)的羥基自由基清除能力。因此，確定在最優(yōu)制備條件下，降解8 h所得為最佳抗氧化SRP片段。此外，在今后的研究工作中，應(yīng)進(jìn)一步深入研究SRP的精細(xì)結(jié)構(gòu)，包括其分子量分布分析、單糖組成和構(gòu)效關(guān)系等，將有助于更加深入的探討其生物學(xué)功能。