王金明，徐慧淼，張 杰，高宇鳳，趙陽(yáng)飛，李妍妍

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801)

氟是自然界普遍存在的一種化學(xué)元素，具有強(qiáng)氧化性，適量的氟有利于機(jī)體的健康，但過量氟亦可導(dǎo)致氟中毒[1]。氟中毒主要是以危害骨骼和牙齒等骨相組織，但近年來(lái)隨著眾多學(xué)者對(duì)氟致非骨相系統(tǒng)深入的研究發(fā)現(xiàn)氟對(duì)心、肝、腎、腦、睪丸等具有廣泛的損傷作用[2-6]。腎作為機(jī)體的主要排泄器官，進(jìn)入機(jī)體約85% 的氟要通過腎隨尿液排出，而且腎中腎小球和腎小管對(duì)氟有濾過及重吸收作用，故腎成為氟中毒最容易受損的靶器官之一[2-3,7]。關(guān)于氟中毒腎損傷的機(jī)制主要包括腎組織脂質(zhì)過氧化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，自由基損害等[8-10]。眾多的研究發(fā)現(xiàn)氟中毒導(dǎo)致腎損傷的機(jī)制與腎細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。楊小蓉等[11]研究發(fā)現(xiàn)，高氟使大鼠腎細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)留，鈣超載可激活calpain，進(jìn)一步激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，去除對(duì)Caspase的抑制作用，使Caspase-3表達(dá)增加導(dǎo)致腎細(xì)胞凋亡加速。張穎等[12]研究報(bào)道氟中毒大鼠腎小管上皮細(xì)胞的凋亡主要是通過刺激Wnt通路中Wnt4、β-catenin的過表達(dá)和E-cadherin低表達(dá)而介導(dǎo)發(fā)生。

然而鈣作為氟中毒的拮抗劑在氟骨癥的防治研究中早有報(bào)道，且得到了極大的應(yīng)用。有報(bào)道稱鈣營(yíng)養(yǎng)不良能加重氟的腎毒性，這種觀點(diǎn)可以從實(shí)驗(yàn)研究和流行病學(xué)觀察中得到證實(shí)[2,5,13]。吳秋云等[13]通過染氟加鈣的方法發(fā)現(xiàn)適量的鈣可拮抗氟致大鼠睪丸組織的損害作用；筆者的前期研究也發(fā)現(xiàn)適當(dāng)劑量的鈣可以在組織學(xué)及血液學(xué)指標(biāo)方面減輕氟對(duì)腎的毒性作用，但過量的鈣反而加劇腎結(jié)構(gòu)的損傷與功能的改變[2]。那么鈣對(duì)氟致腎的損傷分子機(jī)制及多大劑量的鈣能有效緩解氟對(duì)腎的毒性仍不清楚。因此，本研究擬觀察氟中毒大鼠添加不同水平的鈣后腎組織細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡相關(guān)通路中相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)變化，揭示氟致腎細(xì)胞凋亡過程中的分子機(jī)制及不同水平鈣對(duì)其緩解的作用，為在生產(chǎn)實(shí)踐中正確使用高鈣日糧防治氟中毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組處理

選用120只雄性SD大鼠(購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，適應(yīng)1周后隨機(jī)分為5組，對(duì)照組C(常規(guī)飼料)、高氟組F(常規(guī)飼料，含150 mg·kg-1F-)、高氟低鈣組L(常規(guī)飼料，含150 mg·kg-1F-+0.5% CaCO3)、高氟中鈣組M (常規(guī)飼料，含150 mg·kg-1F-+1% CaCO3)和高氟高鈣組H (常規(guī)飼料，含150 mg·kg-1F-+2% CaCO3)，試驗(yàn)期間所有大鼠均自由采食和自由飲水，試驗(yàn)環(huán)境控制在12 h光照和12 h黑暗，溫度控制在23～25 ℃，濕度控制在50%～60%范圍內(nèi)，定期為實(shí)驗(yàn)大鼠更換墊料，保證良好的飼養(yǎng)環(huán)境，在試驗(yàn)期120 d時(shí)隨機(jī)選出6只大鼠并采取腎組織，一部分放入10%中性甲醛固定，一部分放入液氮后于-82 ℃冰箱低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)儀器

氟化鈉(NaF，AR)購(gòu)自天津市化學(xué)試劑三廠；Trizol、Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser、Two Step SYBR RT-PCR Kit和DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa；DEPC購(gòu)自Sigma公司；β-actin、Caspase-12、JNK、Bax、Bcl-2蛋白抗體(均來(lái)源于家兔)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的Goat Anti-Rabbit IgG均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。Mx3000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Stratagene公司)；D-3752高速冷凍離心機(jī)(Sigma公司)；BX51型生物顯微鏡(日本OLYMPUS)；DL-CJ-1ND醫(yī)用型超凈工作臺(tái)(北京哈東聯(lián)公司)；FluorChem Q熒光成像系統(tǒng)(美國(guó)Alpha)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BioRad公司)

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 組織病理學(xué)觀測(cè)及免疫組織化學(xué)檢測(cè) 腎組織用中性甲醛固定后，修整組織塊，用流水沖洗12 h，梯度乙醇和二甲苯依次脫水，將組織浸蠟、包埋、切片(厚度為5 μm)、HE染色，用生物顯微鏡觀察腎組織的病理變化。免疫組織化學(xué)檢測(cè)是將切片常規(guī)脫蠟至水，30% H2O2滅活內(nèi)源性酶，熱修復(fù)抗原，5% BSA封閉，加適當(dāng)稀釋的Bcl-2和Bax抗體4 ℃過夜，再加Goat Anti-Rabbit IgG，然后用SABC和DAB顯色試劑顯色，最后用蘇木素輕度復(fù)染2 min。脫水，透明，封片，用BX51型生物顯微鏡采集圖片。

1.3.2 Real-time PCR反應(yīng)

1.3.2.1 總RNA的提取、cDNA的合成及質(zhì)量鑒定：利用TRIZOL試劑提取腎中的總RNA，通過Nano-drop-2000測(cè)定其濃度及A260 nm/A280 nm，按照Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser說(shuō)明書對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，置于-82 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 熒光定量RT-PCR引物設(shè)計(jì)與合成：由美國(guó)國(guó)立生物信息技術(shù)中心(NCBI)和Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)大鼠Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12、IRE1、TRAF2、ASK1、JNK基因的引物，同時(shí)以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin，GenBank登錄號(hào)NM-031144.2)為內(nèi)參基因檢測(cè)和比較各RNA樣品的完整性及其反轉(zhuǎn)錄效率之間的差別，引物序列及大小見表1。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3.3 圖像采集和數(shù)據(jù)分析 將采集的經(jīng)免疫組織化學(xué)染色的圖片在同一條件下運(yùn)用生物顯微鏡采集各個(gè)試驗(yàn)組圖像10張，應(yīng)用專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行平均光密度分析，之后用Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)免疫組化和熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，進(jìn)行差異性顯著的分析。

1.3.4 Western blot檢測(cè)腎凋亡相關(guān)蛋白 腎組織加入蛋白裂解液裂解，收集蛋白樣品后測(cè)定蛋白樣品的濃度。蛋白樣品加入適量的上樣緩沖液，混勻后加熱到100 ℃變性10 min，冷卻到室溫后待上樣，將樣品加入到SDS-PAGE加樣空內(nèi)以恒壓 80 V進(jìn)行電泳，至分離膠后電壓調(diào)整為恒壓100 V，該過程在冰浴條件下進(jìn)行。電泳后轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(PVDF) 膜上，采用恒壓35 V轉(zhuǎn)膜2 h，封閉2 h后，用β-actin、Caspase-12和JNK抗體4 ℃孵育過夜，然后加入對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的Goat Anti-Rabbit IgG孵育2 h，最后采用ECL試劑來(lái)檢測(cè)蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 不同鈣水平對(duì)氟致大鼠腎組織結(jié)構(gòu)損傷的影響

圖1為試驗(yàn)120 d各組大鼠腎組織病理學(xué)結(jié)果：從C組(對(duì)照組)可見腎組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，腎小體分布均勻，腎小囊腔間隙均勻，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，管腔圓滑。F組(高氟組)腎小球腫脹，腎球囊間隙變寬，近曲小管上皮細(xì)胞腫脹并出現(xiàn)空泡變性。L組(高氟低鈣組)腎組織形態(tài)并未出現(xiàn)明顯異常變化，腎小體分布均勻，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，M組(高氟中鈣組)和H組(高氟高鈣組)腎組織可見明顯的損傷，腎球囊間隙不均勻。但M組損傷程度較F組有所減輕；在H組,腎小體分布不均，腎小管模糊不清，腎小管上皮細(xì)胞聚集在一起，損傷程度較F組更加嚴(yán)重。

2.2 不同鈣水平對(duì)氟致大鼠腎細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

從圖2可以看出，在試驗(yàn)120 d時(shí)，氟中毒大鼠腎內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路中IRE1、ASK1、TRAF2基因mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低(P<0.05，P<0.01或P<0.001)，而JNK、Caspase-12、Caspase-3基因表達(dá)量則極顯著升高(P<0.01或P<0.001)。與F組相比較，L、M和H三組在腎內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路中TRAF2、ASK1基因mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05或P<0.01)，IRE1基因mRNA表達(dá)量?jī)H在M組極顯著升高(P<0.01)；而Caspase-12、Caspase-3(H組除外)基因mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05或P<0.01)；JNK基因mRNA表達(dá)量在H組顯著降低(P<0.05)，在M和L組表達(dá)量沒有顯著變化。在120 d的試驗(yàn)中，Caspase-9基因mRNA表達(dá)量各試驗(yàn)組中均無(wú)顯著性變化(P>0.05)。

表1試驗(yàn)中所用到的引物序列

Table1Primersequencesusedinthepresentstudy

基因Gene登錄號(hào)Accession No.引物序列(5′→3′)Primer sequences產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpProduct sizesβ-actinNM-031144.2F:TACCCAGGCATTGCTGACAG115R:AGCCACCAATCCACACAGAGIRE1NM-001191926F:ATCCCTGATGACTTCGTGCG84R:TCTGCACAGTTCCATGGCTCTRAF2NM-001107815F:AGAGAGCAGTTCGGCCTTTC123R:TCGTGGCAGCTCTCGTATTCASK1NM-001277694F:GTTGAGGCCACATTTCAGCC81R:TCCTCGTGTTCATCGTCGACJNKNM-053829F:TTCGCCGTCTGTCAATGACA108R:CATCTACAGCAGCCCAGAGGCaspase-9AY027667.1F:AGCCAGATGCTGTCCCATAC148R:CAGGAACCGCTCTTCTTGTCCaspase-12NM-130422.1F:GGACATGCTGGATGGAGTTT116R:CCAGGTTCTCAGCTTTGCTCCaspase-3BC081854.1F:TGACTGGAAAGCCGAAACTC101R:GCATGCCATATCATCGTCAG

C.對(duì)照組；F.高氟組(飼料含150 mg·kg-1 F-)；L.高氟低鈣組(飼料含150 mg·kg-1 F-+0.5% CaCO3)；M.高氟中鈣組(飼料含150 mg·kg-1 F-+1% CaCO3)；H.高氟高鈣組(飼料含150 mg·kg-1 F-+2% CaCO3)；以下圖表分組情況均同此處。箭頭標(biāo)注為腎球囊間隙的變化C. Control group; F. High fluoride group (feed containing 150 mg·kg-1 F-); L. High fluoride and low calcium group (feed containing 150 mg·kg-1 F-& 0.5% CaCO3); M. High fluoride and medium calcium group (feed containing 150 mg·kg-1 F-& 1% CaCO3); H. High fluoride and high calcium group (feed containing 150 mg·kg-1 F-& 2% CaCO3); The grouping of following charts are in the same way as here. The arrows represent changes in the capsule of glomerulus clearance圖1 大鼠腎超微結(jié)構(gòu)觀察Fig.1 Ultrastructure observation of kidney in rat

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)不同鈣水平對(duì)氟致大鼠腎細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖3為試驗(yàn)120 d大鼠腎組織Bax蛋白免疫組化表達(dá)的結(jié)果，從圖中可以看出，與C組相比，F(xiàn)組Bax陽(yáng)性染色較多；與F組相比，L、M和H組的Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相對(duì)較少，L組較M和H組的Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相對(duì)較少。說(shuō)明氟可以使得Bax蛋白在腎組織中表達(dá)升高，而低劑量的鈣有顯著抑制氟引起B(yǎng)ax在腎中的高表達(dá)作用。

試驗(yàn)120 d大鼠腎組織Bcl-2蛋白免疫組化結(jié)果見圖4?？梢钥闯?，與C組相比，F(xiàn)組Bcl-2的陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少；但與F組相比，L、M和H組的Bcl-2陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)有所增多，且隨著鈣劑量的增加而減少。說(shuō)明氟可以降低Bcl-2蛋白在腎組織中表達(dá)，而低劑量的鈣對(duì)氟引發(fā)的Bcl-2在腎中的表達(dá)下降有較好的緩解作用。

由圖5可知，與C組相比，F(xiàn)組Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；L和M組中Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)量較F組中均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，而H組無(wú)顯著差異。

2.4 不同鈣水平對(duì)氟致大鼠腎細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

免疫印跡測(cè)定試驗(yàn)120 d時(shí)Caspase-12和JNK蛋白表達(dá)水平見圖6，可以看出，與對(duì)C相比，F(xiàn)組Caspase-12和JNK蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與F組相比，L和M組Caspase-12及JNK蛋白表達(dá)降低且差異顯著(P<0.05或P<0.01)，而H組差異不顯著。表明氟可以激活JNK通路及Caspase-12通路中的蛋白表達(dá)，而低、中劑量的鈣可顯著抑制氟誘導(dǎo)這兩種蛋白的過量表達(dá)。

與F組相比較, *.P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001Compared with group F, *.P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001圖2 不同鈣水平對(duì)氟致大鼠腎內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平Fig.2 Different calcium level of fluoride induced rat kidney injury endoplasmic reticulum stress related gene expression level

圖3 大鼠腎組織免疫組化Bax蛋白表達(dá)Fig.3 The expression of Bax protein in kidney of rats

圖4 大鼠腎組織免疫組化Bcl-2蛋白表達(dá)Fig.4 The expression of Bcl-2 protein in kidney of rats

與F組相比較, *.P<0.05, **.P<0.01Compared with group F, *.P<0.05, **.P<0.01圖5 大鼠腎中蛋白Bax/Bcl-2的比值Fig.5 The ratio of Bax/Bcl-2 protein in kidney of rats (n=10,

3 討 論

3.1 氟中毒及不同水平鈣對(duì)腎損傷作用的影響

氟中毒是全世界廣泛存在的一種人畜共患性的地方病，主要臨床癥狀是氟斑牙和氟骨癥。但近年來(lái)眾多的學(xué)者從流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)高氟不但對(duì)硬組織造成損傷，還可導(dǎo)致全身軟組織器官發(fā)生損傷[1，14-15]。腎作為機(jī)體氟主要的代謝和排泄器官，長(zhǎng)期處于高氟環(huán)境的刺激下，更加容易導(dǎo)致組織受損。張穎等[12]研究發(fā)現(xiàn)隨著氟攝入量的增加，大鼠骨氟、尿氟顯著升高，腎小管上皮細(xì)胞腫脹明顯加重，導(dǎo)致腎功能受損。本課題的前期研究[2]也發(fā)現(xiàn)高氟導(dǎo)致大鼠腎各種代謝產(chǎn)物及血液中的肌酐、尿素氮、LDH、SDH、ALP含量發(fā)生改變，而中、低劑量鈣可以不同程度地減輕腎功能損傷和形態(tài)的改變，對(duì)腎組織具有一定程度的保護(hù)作用。所以，研究氟導(dǎo)致腎組織細(xì)胞凋亡的途徑及抑制氟的細(xì)胞毒性作用成為減緩氟中毒的關(guān)鍵。

與F組相比較, *.P<0.05, **.P<0.01Compared with group F, *.P<0.05, **.P<0.01圖6 120日齡各組大鼠腎免疫印跡雜交條帶Fig.6 Western blotting band of the kidney in rat of each group at 120 d (n=5,

生物學(xué)上拮抗氟的毒性作用的研究較多，但由于鈣本身的使用范圍較廣，毒副作用較低成為人們研究的熱點(diǎn)之一。據(jù)徐輝等[16]的研究顯示，氟中毒后腎細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度發(fā)生巨大的變化，本課題組前期的研究也顯示細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)與鈣缺乏有著非常密切的聯(lián)系，而細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化會(huì)直接激發(fā)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞的損傷，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生死亡[17]。低鈣對(duì)機(jī)體整體的危害不僅僅表現(xiàn)在神經(jīng)、內(nèi)分泌中，在亞細(xì)胞水平來(lái)看內(nèi)質(zhì)網(wǎng)更為敏感[18]。蛋白的折疊、分子伴侶的功能維持都需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔保持高水平的Ca2+。破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+穩(wěn)態(tài)的因素可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可引起Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔釋出進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，促使Ca2+進(jìn)入細(xì)胞核和線粒體，進(jìn)而促進(jìn)ROS的生成誘導(dǎo)凋亡[19]。因此，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路研究外源性補(bǔ)充鈣對(duì)緩解氟的毒性研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

3.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡相關(guān)通路

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是針對(duì)外界不利因素的保護(hù)性應(yīng)答反應(yīng),有報(bào)道稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與多種腎毒物引發(fā)的腎損傷機(jī)制密切相關(guān)[20-21]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以觸發(fā)以未折疊蛋白反應(yīng)為核心的相關(guān)信號(hào)通路應(yīng)答發(fā)生變化。在長(zhǎng)期或嚴(yán)重的應(yīng)激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路主要有以下3條[22-24]：①JNK(c-jun N-terminal kinases)信號(hào)通路；②Caspase-12信號(hào)通路，③CHOP (CAAT/enhancer-binding protein-homologous protein)信號(hào)通路，其中IRE1介導(dǎo)的JNK信號(hào)通路和Caspase-12信號(hào)通路是我們關(guān)注的重點(diǎn)。第1條凋亡通路是在高氟的長(zhǎng)期刺激下，活化的IRE1與TRAF2 (TNF receptor associated factor 2) 相互聚集，激活凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)而形成IRE1/TRAF2/ASK1三聚體而激活JNK，JNK磷酸化后可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和激活BAX的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25-26]。第2條凋亡通路是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜的Caspase-12通過多種途徑激活Caspase-12凋亡通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有大量的研究報(bào)道活化的Caspase-12在無(wú)細(xì)胞色素C的參與下能激活下游的Caspase-9和Caspase-3,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19,27]。

3.2.1 氟中毒及不同水平鈣對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡JNK信號(hào)通路的影響 本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比較，高氟使IRE1、TRAF2、ASK1基因表達(dá)顯著降低，而JNK基因及蛋白的表達(dá)量均顯著升高。這正是由于高氟長(zhǎng)期刺激導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)持續(xù)應(yīng)激使得活化的IRE1與TRAF2相互作用激活A(yù)SK1形成IRE1/TRAF2/ASK1三聚體而激活JNK，導(dǎo)致游離的IRE1、TRAF2、ASK1表達(dá)量降低。但在高氟補(bǔ)鈣后IRE1、TRAF2、ASK1基因的表達(dá)量較F組均有升高，在M組中差異均顯著；而JNK基因的表達(dá)量有下降趨勢(shì)，只有在高氟高鈣組中差異顯著，但JNK蛋白的表達(dá)量在L和M組均顯著下降。Liu等[14]和張亞樓等[28]分別研究發(fā)現(xiàn)氟化鈉可通過IRE1途徑導(dǎo)致Wistar大鼠甲狀腺細(xì)胞和人成骨細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而凋亡，其中IRE1蛋白表達(dá)顯著升高。閆婷等[29]用25 mg·(kg·d)-1氟化鈉給大鼠灌胃，7周后檢測(cè)睪丸組織中IRE1及JNK mRNA水平及蛋白的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)睪丸組織中IRE1及JNK的基因及蛋白表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，以上這些研究報(bào)道均證實(shí)了高氟可以通過IRE1介導(dǎo)JNK通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，與本研究的結(jié)果相一致。孫景春等[30]用低鈣日糧大鼠氟中毒腎損傷的研究指出，低鈣營(yíng)養(yǎng)可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)一步加劇氟對(duì)腎的損傷作用，這也印證了本研究中補(bǔ)充低劑量鈣可以緩解氟對(duì)腎通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用機(jī)制。

Bcl-2、Bax是細(xì)胞內(nèi)刺激途徑中Bcl-2家族成員。Bcl-2具有抑制凋亡作用，Bax具有促進(jìn)凋亡作用[9,31]。有研究報(bào)道，外界持續(xù)的刺激不僅可以活化JNK通路，同時(shí)JNK可促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax的磷酸化，激活細(xì)胞內(nèi)Bax的表達(dá)，同時(shí)抑制Bcl-2的表達(dá)[19,32]。氟中毒大鼠腎組織中Bcl-2的表達(dá)量隨NaF濃度的增加而逐漸降低，而Bax基因的表達(dá)量則顯著升高[9]。向程窈等[7]報(bào)道不同濃度的氟均可誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡，隨著氟濃度增加，凋亡細(xì)胞增多;腎小管上皮細(xì)胞Bcl-2表達(dá)隨氟劑量增加而逐漸下降，Bax表達(dá)則逐漸增加。本研究通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，在腎組織中高氟組腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中Bax陽(yáng)性細(xì)胞的染色較多，Bcl-2陽(yáng)性染色則較少，Bax/Bcl-2的比值顯著升高，這與其他學(xué)者的研究報(bào)道相一致[31,33]。Yang等[33]和Cao等[31]分別用不同劑量的氟化鈉處理成骨細(xì)胞和鯉魚腎的研究發(fā)現(xiàn)，氟中毒可使MC3T3-E1成骨細(xì)胞和鯉魚腎中Bax/Bcl-2的比率顯著升高。表明凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2可能均參與了大鼠慢性氟中毒時(shí)腎損傷的發(fā)生發(fā)展過程。在氟中毒后添加中、低劑量的鈣對(duì)氟引起的Bcl-2表達(dá)下降和Bax的表達(dá)升高有很好的抑制作用，這一結(jié)果也與筆者的前期研究用低、中劑量的鈣能緩解腎氟中毒的研究相吻合[2]，同時(shí)提示低、中劑量的鈣可以通過抑制氟對(duì)腎Bcl-2家族成員的蛋白表達(dá)的影響緩解氟的腎毒性作用。

3.2.2 氟中毒及不同水平鈣對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡Caspase-12信號(hào)通路的影響 有大量研究表明細(xì)胞凋亡是由多因子復(fù)雜的相互作用誘導(dǎo)產(chǎn)生凋亡信號(hào)，當(dāng)信號(hào)傳遞至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上Caspase-12信號(hào)時(shí)就會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[27,34]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)組中Caspase-12和Caspase-3 mRNA的表達(dá)量均顯著高于C組，用Western blot檢測(cè)了Caspase-12蛋白的表達(dá)與基因相一致；與F組相比，L和M組Caspase-12和Caspase-3基因的表達(dá)量顯著降低；Caspase-12蛋白的表達(dá)L和M組顯著低于F組。這與Zhang等[27]研究報(bào)道高氟對(duì)SD大鼠的神經(jīng)細(xì)胞Caspase-12、Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)量顯著升高相一致。不同氟劑量誘導(dǎo)大鼠腎細(xì)胞凋亡中發(fā)現(xiàn)，高氟可使得腎細(xì)胞Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)量均顯著升高導(dǎo)致腎細(xì)胞發(fā)生凋亡[34]。不同水平鈣對(duì)氟誘導(dǎo)腦細(xì)胞損傷的研究中指出，高氟可使Bcl-2表達(dá)顯著下降，而Caspase-12顯著升高，高鈣(日糧中含7%)可以使得氟對(duì)腦細(xì)胞的毒性作用明顯減緩，降低Caspase-12的表達(dá)量，同時(shí)增加Bcl-2的表達(dá)[5]。提示高氟不僅可以通過JNK信號(hào)通路引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，也可以通過Caspase-12通路導(dǎo)致腎發(fā)生損傷；同時(shí)，補(bǔ)充中劑量的鈣可以有效緩解高氟誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

4 結(jié) 論

氟中毒可以使大鼠腎組織細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路中JNK通路和Caspase-12通路中的JNK、Caspase-12、Caspase-3、IRE1、TRAF2、ASK1基因及JNK、Caspase-12、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)發(fā)生顯著變化，引起腎細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡加速。在飲食中添加低、中劑量的鈣可通過抑制氟誘導(dǎo)腎組織細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中JNK信號(hào)通路和Caspase-12信號(hào)通路有效緩解氟的腎毒性作用。