陳 亞，魏全偉，杜文超，鄭衛(wèi)江，丁 威，邢 軍，石放雄

(南京農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，南京210095)

據(jù)調(diào)查，全世界約有25%的谷物被霉菌毒素污染[1]，豬攝入真菌污染的飼料后，生長性能、繁殖性能、存活率下降。近年來，霉菌毒素對母畜繁殖系統(tǒng)的影響及其毒性作用已被廣泛關注。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇又名嘔吐素(deoxynivalenol,DON),與玉米赤酶烯酮(zearalenone, ZEA/ZEN)是鐮刀菌毒素中污染飼料和谷物最為嚴重的兩種污染菌毒素。鐮刀菌毒素能夠導致家畜一系列生殖障礙疾病。DON不僅能抑制豬卵母細胞成熟、胚胎發(fā)育[2]，還會影響豬顆粒細胞類固醇的合成[3]。此外，若家畜短期攝入大量DON會引起嘔吐、腹瀉甚至死亡[4]，長期攝入含DON的飼糧，會導致采食量降低，從而引起體重減輕，影響發(fā)育與產(chǎn)仔[5]。ZEA與雌激素結構相似，可與雌激素受體結合。ZEA可導致母豬外陰腫脹、充血[6]，并能抑制小鼠卵母細胞成熟[7]。高劑量的ZEA還能抑制豬卵巢顆粒細胞的增殖，導致細胞凋亡和壞死[8]。但是目前關于DON與ZEA聯(lián)合作用對斷奶仔豬卵巢的影響鮮有報道。

乳果糖是人工合成的不容易被人體吸收的雙糖，口服后不能被人體吸收，但能被大腸內(nèi)細菌分解，產(chǎn)生大量氫氣。氫氣作為一種還原性氣體，能夠有效抑制氧化應激、炎癥反應以及細胞凋亡[9]。富氫水灌胃與直接吸入氫氣效果相近。Zheng等[10]發(fā)現(xiàn)，乳果糖能夠改善用大豆苷元處理公豬的肝抗氧化狀態(tài)；此外，Tamaki等[11]進一步研究發(fā)現(xiàn)，富氫水會誘導大鼠腭組織中抗氧化防御通路的激活，從而減少全身氧化應激和降低促炎細胞因子水平。但是，乳果糖與富氫水能否緩解DON、ZEA對機體造成的影響未見有文獻報道。

本試驗以斷奶仔豬為研究對象，探究在乳果糖、富氫水作用下，采食鐮刀菌污染玉米的仔豬卵巢組織形態(tài)、抗氧化狀態(tài)以及NOS水平的變化情況。探討霉菌毒素、乳果糖與富氫水的作用機制，為研究霉菌毒素對雌性生殖系統(tǒng)的毒性機理以及脫毒方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定試劑盒、琥珀酸脫氫酶(SDH)測定試劑盒、一氧化氮(NO)、一氧化氮酶(NOS)試劑盒、蘇木素伊紅染料均購自南京建成生物工程研究所； SABC免疫組化試劑盒、3種兔源多克隆抗體(nNOS、iNOS、eNOS)、DAB顯色試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。全自動酶標儀Multiskan GO購于Thermo Scientificr公司，組織勻漿機購于OMMI公司。

1.2 試驗動物以及樣品采集

選取健康的21日齡，平均體重為(7.25±1.02)kg的杜洛克×長白×大白三元雜交斷奶母豬24頭進行試驗，隨機分為4個處理，每個處理組6個重復，每個重復1頭豬，試驗期25 d。4個處理組的日糧分別為：對照組飼喂基礎日糧；霉變玉米組、乳果糖緩解組和富氫水緩解組飼喂霉變飼料。此外，乳果糖緩解組和富氫水緩解組分別用乳果糖和富氫水進行每天2次灌胃。灌胃時間為每天的08:00和14:00，乳果糖灌胃量為500 mg·kg-1，富氫水的灌胃量為10 mL·kg-1。在試驗結束時屠宰仔豬，采集卵巢，將一側卵巢組織放入-80 ℃進行抗氧化各項指標的測定，另一側卵巢固定于4%多聚甲醛中，以便對卵巢進行組織學分析以及檢測NOS在卵巢上的表達定位。

1.3 試驗飼糧以及動物飼養(yǎng)管理

以玉米和豆粕配制基礎日糧，基礎日糧配方參照NRC(1998)營養(yǎng)需要配置，基礎日糧組成以及營養(yǎng)水平見表1；并且乳果糖緩解組與富氫水緩解組另外灌胃乳果糖和富氫水(每300 mL富氫水氫氣含量為1.2 mg·kg-1)。

試驗在江蘇句容某豬場進行，每天加料2次，保證斷奶仔豬自由采食與飲水，豬舍溫度控制在27 ℃，濕度保持在60%，保證通風環(huán)境，每日打掃衛(wèi)生，及時更換墊料。

1.4 試驗方法

1.4.1 仔豬卵巢形態(tài)學觀察 用4%的多聚甲醛溶液固定仔豬卵巢24 h，隨后用酒精逐級脫水，并用二甲苯透明。再通過包埋機浸蠟、包埋等處理后，切片機切片(5 μm)，經(jīng)過蘇木素-伊紅染色后，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

每組選擇3個樣本，每個樣本選3張切片，每間隔 100 μm(約 20 張切片)選一張片子進行觀察與統(tǒng)計，每張切片選 3～4個視野。統(tǒng)計原始卵泡(健康/閉鎖)和生長卵泡(健康/閉鎖)(盡量選擇結構完整的卵泡)的數(shù)量。按照Schoevers等[12]的試驗方法統(tǒng)計原始卵泡和生長卵泡的比例以及單位視野中各級卵泡數(shù)與總卵泡數(shù)之比。

1.4.2 仔豬卵巢免疫組織化學分析 為了驗證nNOS、iNOS、eNOS在斷奶仔豬卵巢的表達定位，本研究使用ABC法進行免疫組織化學測定。組織切片脫蠟后，用5%小牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h,一抗nNOS、iNOS、eNOS(兔源，稀釋倍數(shù)1∶150)4 ℃孵育過夜，生物素標記的抗兔IgG抗體(稀釋倍數(shù)1∶200)室溫孵育2 h,之后與ABC試劑反應1 h, 3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色30～60 s，最后用蘇木素復染、脫水透明、封片。PBS取代一抗作為空白對照，YS100 光學顯微鏡觀察并拍照，細胞內(nèi)棕褐色代表陽性表達。隨機抽取3名免疫組化研究人員對染色強度進行觀察測定：-表示無染色，﹢表示染色弱，﹢﹢表示染色適中，﹢﹢﹢表示染色強烈。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

①. 維生素和礦物質(zhì)預混料為每千克日糧提供：VA 9 000 IU;VD31 800 IU;VE 40 IU;VK31.8 mg;VB13 mg;VB24.5 mg;VB610 mg;VB120.08 mg;VC 100 mg;煙酸 28 mg;泛酸 16 mg;葉酸 2 mg;生物素 0.2 mg;氯化膽堿 800 mg;Zn 55 mg;Cu 30 mg;Mn 60 mg; Fe 120 mg;I 1 mg; Co 2 mg;Se 0.3 mg。②. 基于干物質(zhì)含量88%

①. Vitamin and mineral premix provided the following for per kilogram of diet: VA 9 000 IU; VD31 800 IU; VE 40 IU; VK31.8 mg; VB13 mg; VB24.5 mg; VB610 mg; VB120.08 mg; VC 100 mg; niacin 28 mg; pantothenic acid 16 mg; folic acid 2 mg; biotin 0.2 mg; Chlorination choline 800 mg;Zn 55 mg;Cu 30 mg;Mn 60 mg;Fe 120 mg;I 1 mg;Co 2 mg;Se 0.3 mg.②. Based on dry matter content 88%

1.4.3 仔豬卵巢中NO含量以及NOS活性的測定 試驗采用硝酸還原酶法測定卵巢組織中NO含量，試驗步驟按照NO試劑盒說明書進行。采用NOS試劑盒測定卵巢組織勻漿中總NOS活力，試驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.4 仔豬卵巢組織中Caspase-3活性的測定 Caspase-3是細胞凋亡過程中最重要的終末剪切酶，檢測其活性可以有效評估細胞組織發(fā)生凋亡的程度，試驗加樣順序按照Caspase-3活性測定試劑盒說明書進行，用酶標儀在405 nm處測定吸光值。

1.4.5 仔豬卵巢組織中各種酶活性測定 仔豬卵巢組織中過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、琥珀酸脫氫酶(SDH)活性的測定均嚴格按照相應試劑盒試驗步驟以及加樣順序進行。

1.5 統(tǒng)計學分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),使用最小顯著差異法(least significant difference，LSD)進行顯著性分析，以P<0.05 表示差異顯著，結果用“平均值±標準誤(Mean±SEM)”表示。

2 結 果

2.1 霉變玉米、乳果糖、富氫水對斷奶仔豬卵巢重量的影響

為了測定ZEA與DON對卵巢發(fā)育的影響，本研究稱量了卵巢重量(圖1)。結果顯示，4組仔豬卵巢重量無顯著差異(P>0.05)，但霉變玉米組與對照組相比卵巢重量有上升趨勢。此外，霉變玉米組的卵巢相對重量顯著高于對照組(P<0.05)；而與霉變玉米組相比，乳果糖與富氫水緩解組卵巢相對重量有下降趨勢。

CON. 對照組；MC. 霉變玉米組；MC+LAC. 乳果糖緩解組；MC+HRW. 富氫水緩解組。標記字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同CON. Control group; MC. Mildew corn group; MC+LAC. Lactulose relieving group; MC+HRW. Hydrogen-rich water relieving group. Different superscript letters indicate significant differences among groups(P<0.05), the same as follows圖1 霉變玉米、乳果糖和富氫水對斷奶仔豬卵巢重量和卵巢相對重量的影響Fig.1 Effects of contaminated corn, lactulose and hydrogen-rich water on the ovarian weight and relative ovarian weight of weaned piglets

2.2 霉變玉米、乳果糖、富氫水對斷奶仔豬卵巢形態(tài)學的影響

為了觀察DON與ZEA對仔豬卵巢形態(tài)學的影響，本研究進行了HE染色(圖2)。結果顯示，4組均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的病理變化，但與對照組相比，霉變玉米組加速了仔豬卵巢的發(fā)育(圖2、圖3)。對照組在卵巢皮質(zhì)部淺部存在大量原始卵泡，在皮質(zhì)深層部位，出現(xiàn)較多生長卵泡，未見有腔卵泡(圖2A)；而霉變玉米組在不同發(fā)育狀態(tài)的卵泡數(shù)量發(fā)生明顯的變化(圖2B)，原始卵泡數(shù)量顯著低于對照組(P<0.05)，生長卵泡數(shù)量顯著高于對照組(P<0.05)(圖3)；用富氫水與乳果糖處理后，與霉變玉米組相比仔豬卵巢原始卵泡數(shù)量明顯增加，生長卵泡數(shù)量明顯減少(圖2、圖3)。

2.3 霉變玉米、乳果糖、富氫水對斷奶仔豬卵巢SDH、CAT、GSH-PX和T-SOD水平影響

為了測定ZEA與DON對卵巢組織抗氧化狀態(tài)的影響，以及乳果糖、富氫水的緩解作用，本研究測定了抗氧化指標CAT、GSH-PX與T-SOD活性(圖4)。結果顯示，與對照組相比，霉變玉米組CAT活性顯著升高(P<0.05)；GSH-PX活性顯著下降(P<0.05)；T-SOD活性雖無顯著變化(P>0.05)，但有下降趨勢。與霉變玉米組比較，乳果糖與富氫水緩解組CAT活性有下降趨勢，但是變化不顯著(P>0.05)；乳果糖緩解組GSH-PX活性顯著升高，富氫水緩解組其活性雖然無顯著變化(P>0.05)，但有上升趨勢；T-SOD活性在乳果糖與富氫水緩解組有上升趨勢(P>0.05)。SDH是線粒體三羧酸循環(huán)標志酶，其活性標志著三羧酸循環(huán)的活躍程度，可以間接反映線粒體功能。為了研究霉變玉米對斷奶仔豬線粒體功能的影響，本研究測定了SDH活性。結果表明，霉變玉米組SDH活性顯著低于對照組(P<0.05)；此外，與霉變玉米組相比，乳果糖緩解組SDH活性顯著升高(P<0.05)；富氫水緩解組SDH活性雖變化不顯著(P>0.05)，但有上升趨勢。

2.4 霉變玉米、乳果糖、富氫水對仔豬卵巢組織Caspase-3活性的影響

為了評估斷奶仔豬卵巢組織細胞的凋亡程度以及乳果糖、富氫水的緩解作用，本研究測定了Caspase-3活性(圖5)。與對照組相比，霉變玉米組Caspase-3活性顯著升高(P<0.05)；而乳果糖和富氫水緩解組與霉變玉米組相比Caspase-3活性顯著降低(P<0.05)。

A.對照組；B. 霉變玉米組；C. 富氫水處理組；D. 乳果糖處理組;Pm. 原始卵泡;Pr. 初級卵泡;Se. 次級卵泡A. Control group; B. Contaminated corn group; C. Hydrogen-rich water treatment group; D. Lactulose treatment group. Pm. Primordial follicle; Pr. Primary follicle; Se. Secondary follicle圖2 霉變玉米、乳果糖和富氫水對斷奶仔豬卵巢形態(tài)學的影響Fig.2 Effects of contaminated corn, lactulose and hydrogen-rich water on ovarian morphology of weaned piglets

圖3 仔豬卵巢原始卵泡和生長卵泡的分布比例Fig.3 The proportion of primordial follicles and growing follicles in the ovary of piglets

2.5 nNOS、iNOS、eNOs在斷奶仔豬卵巢中的表達定位

為了測定3種NOS亞型在斷奶仔豬卵巢的表達定位，本研究進行了免疫組化試驗。由圖6和表2可知，nNOS在斷奶仔豬各級卵泡的卵母細胞弱表達，在初級卵泡、次級卵泡的顆粒細胞和次級卵泡的膜細胞中也有適度表達，但在原始卵泡的顆粒細胞中未見表達(圖6 A1～A3)；iNOS在斷奶仔豬各級卵泡的卵母細胞中強表達，在初級卵泡和次卵泡的顆粒細胞中同樣表達強烈，但在原始卵泡的顆粒細胞表達適中，次級卵泡的膜細胞中弱表達(圖6 B1～B3)；eNOS在斷奶仔豬原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡的卵母細胞表達適中，次級卵泡的膜細胞中弱表達。此外還發(fā)現(xiàn)，隨著卵泡的發(fā)育，eNOS在顆粒細胞中的表達逐漸增強(圖6 C1～C3)；陰性對照組無特異性免疫染色(圖6 D1～D3)。3種NOS亞型在卵巢不同細胞的相對表達水平見表2。

2.6 霉變玉米、乳果糖、富氫水對仔豬卵巢組織NO含量和NOS活性的影響

由圖7可知，霉變玉米會改變仔豬卵巢NO含量和NOS活性。與對照組相比，NO含量和NOS活性在霉變玉米組中顯著升高(P<0.05)；此外，與霉變玉米組相比，乳果糖和富氫水緩解組NO含量顯著下降(P<0.05)，富氫水緩解組總NOS活力與霉變玉米組相比也顯著下降(P<0.05)，乳果糖緩解組總NOS活力雖然與霉變玉米組沒有顯著差異(P>0.05)，但有下降趨勢。

圖4 霉變玉米、乳果糖和富氫水對斷奶仔豬卵巢CAT、GSH-PX、T-SOD與SDH活性的影響Fig.4 Effects of contaminated corn, lactulose and hydrogen-rich water on the activities of CAT, GSH-PX, T-SOD and SDH in the ovary of weaned piglets

圖5 霉變玉米、乳果糖和富氫水對斷奶仔豬卵巢Caspase-3活化程度的影響Fig.5 Effects of contaminated corn, lactulose and hydrogen-rich water on the levels of Caspase-3 in the ovary of weaned piglets

3 討 論

世界各地的谷物和動物飼料中幾乎都存在霉菌毒素，嚴重危害了人和動物健康。DON與ZEA是主要的鐮刀菌屬毒素，會誘導機體氧化應激。而乳果糖能被厭氧細菌分解產(chǎn)生氫氣，氫氣能緩解氧化應激。本研究結果發(fā)現(xiàn)，乳果糖和富氫水能有效緩解霉菌毒素對卵巢造成的氧化應激影響。

本課題組前期研究已經(jīng)表明，霉變玉米組仔豬體重、平均日增重、平均日采食量均顯著低于對照組，可能是由于仔豬免疫和消化系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，容易受到有毒物質(zhì)的影響，導致仔豬生產(chǎn)性能降低。用乳果糖處理后，仔豬體重、平均日增重與平均日采食量與霉變玉米組相比顯著增加[13]。這可能是由于乳果糖能夠選擇性地改變腸道微生物群的組成和提高腸道完整性。因為乳果糖是通過腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生氫氣來發(fā)揮作用的，所以富氫水同樣能提高仔豬生長性能。因此乳果糖與富氫水能有效緩解霉菌毒素對仔豬生長性能產(chǎn)生的影響。

Schoevers等[12]研究發(fā)現(xiàn)，向母豬飼料中添加1 mg·kg-1ZEA使得子代仔豬卵巢中初級卵泡和次級生長卵泡的密度增高，促進仔豬卵泡發(fā)育。黃麗娜等[14]報道，向母豬飼糧中添加100 mg·kg-1ZEA，能夠促進初級和次級卵泡發(fā)育。楊立杰等[15]同樣研究表明，日糧中添加0～1 mg·kg-1ZEA使得仔豬卵巢指數(shù)線性升高。本研究結果與之一致。

NC. 陰性對照。Pm. 原始卵泡(A1、B1、C1、D1)；Pr. 初級卵泡(A2、B2、C2、D2)；Se. 次級卵泡(A3、B3、C3、D3)。Oo. 卵母細胞；Gc. 顆粒細胞；Tc. 膜細胞NC. Negative control. Pm. Primordial follicles (A1, B1, C1, D1); Pr. Primary follicles (A2, B2, C2, D2); Se. Secondary follicles (A3, B3, C3, D3). Oo. Oocyte; Gc. Granulosa cell; Tc. Theca cell圖6 3種NOS(nNOS、iNOS、eNOS)在斷奶仔豬卵巢中的免疫組織化學檢測Fig.6 Immunolocalization of 3 NOS isoforms(nNOS, iNOS, eNOS)in ovaries of weaned piglets

表23種NOS亞型在斷奶仔豬卵巢中的相對表達水平

Table2Relativeexpressionlevelsof3NOSisoformsinovariesofweanedpiglets

卵泡類型Follicle typenNOSiNOSeNOS原始卵泡 Primordial follicle卵母細胞++++++顆粒細胞-+++初級卵泡 Primary follicle卵母細胞++++++顆粒細胞+++++次級卵泡 Secondary follicle卵母細胞++++++顆粒細胞++++++膜細胞+++

-. 無染色；﹢. 染色弱；﹢﹢. 染色適中；﹢﹢﹢. 染色強烈

-. No staining detected； ﹢. Weak staining; ﹢﹢. Moderate staining; ﹢﹢﹢. Strong staining

圖7 霉變玉米、乳果糖和富氫水對斷奶仔豬卵巢中NO含量和NOS活力的影響Fig.7 Effects of contaminated corn, lactulose and hydrogen-rich water on the NO content and NOS activity in the ovary of weaned piglets

由于ZEA結構與雌激素類似，所以霉變玉米可能短時間促進仔豬卵巢發(fā)育，導致成年豬卵母細胞過早凋亡；本研究發(fā)現(xiàn)，用乳果糖和富氫水處理后，卵泡提早發(fā)育現(xiàn)象得到緩解?？赡苁怯捎谌楣呛推洚a(chǎn)生的氫氣改善了仔豬腸道環(huán)境，從而提高了仔豬的免疫力和消化力，降低了霉菌毒素對仔豬的傷害。但是其具體分子機制尚不清楚，需要做進一步研究。

氧化應激主要表現(xiàn)為自由基增多，當自由基含量超過機體本身的抗氧化能力時，就會造成機體氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失去平衡，從而導致氧化損傷。Ren等[16]研究發(fā)現(xiàn)，分別用0.06 μg·mL-1DON和0.08 μg·mL-1ZEA、0.3 μg·mL-1DON和0.4 μg·mL-1ZEA以及1.5 μg·mL-1DON和2 μg·mL-1ZEA處理豬脾淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)SOD、CAT、GPx、GSH和Bcl-2的信使核糖核酸和蛋白表達水平顯著降低，總抗氧化能力下降。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，仔豬采食了霉變飼料后，卵巢組織GSH-PX、T-SOD活性下降，這與Ren等[16]的研究結果一致，而CAT在霉變玉米組顯著升高，3種抗氧化酶為何變化趨勢不同，目前很難解釋，需做進一步研究?？寡趸富钚缘母淖兛赡苁怯捎诼殉步M織抗氧化水平的改變，由此說明霉變玉米中含有的DON與ZEA介導仔豬卵巢抗氧化能力變化，導致仔豬氧化應激；Zheng等[13]研究發(fā)現(xiàn)，用富氫水和乳果糖處理氧化應激的仔豬，發(fā)現(xiàn)MDA水平下降，而CAT、T-SOD、Mn-SOD水平升高，氧化應激狀態(tài)得到顯著緩解。Shigeta等[17]研究發(fā)現(xiàn)，對缺血再灌注損傷的大鼠腔內(nèi)注射富氫溶液可以緩解氧化應激，從而改善缺血再灌注損傷。這與本試驗結果一致。研究表明，羥基自由基(·OH)和過氧化亞硝酸離子(ONOO-)是非常強的氧化劑，能夠使得脂質(zhì)過氧化以及蛋白質(zhì)失活。而氫氣能夠有效清除機體內(nèi)的·OH和ONOO-。氫氣具有抗氧化作用[18]，因此仔豬灌胃乳果糖與富氫水后，通過氫氣形式在體內(nèi)發(fā)揮作用，從而GSH-PX、T-SOD活性上升，仔豬卵巢抗氧化水平升高；SDH是脫氫酶中最重要的酶，是線粒體三羧酸循環(huán)標志酶，其活性在一定程度上反映了線粒體功能。Yang等[19]報道稱，用DON處理人胃上皮細胞后，線粒體功能下降、呼吸鏈受損、氧消耗率降低。本試驗結果表明，霉變玉米組SDH活性低于對照組，與Yang等[19]的研究結果一致。說明DON與ZEA損害了線粒體功能，影響了線粒體電子傳遞和氧化呼吸作用，使得仔豬體內(nèi)的細胞呼吸作用減弱,產(chǎn)生的能量減少和物質(zhì)代謝速率降低。本試驗研究的乳果糖與富氫水對斷奶仔豬線粒體功能影響未見有其他文獻報道。已有研究指出，若體內(nèi)產(chǎn)生過多的超氧化物未被內(nèi)源性抗氧化劑或相關酶清除，便會導致線粒體功能障礙[20]。由此可知，抗氧化水平降低會影響線粒體功能。而乳果糖與富氫水具有抗氧化作用，因此用乳果糖與富氫水處理仔豬后，卵巢抗氧化水平升高，從而線粒體功能得到改善。

細胞凋亡是細胞正常的程序化死亡，在機體具有一個平衡狀態(tài)，如果平衡被打破，就易發(fā)生自身免疫病、腫瘤等疾病。已有研究證明，ZEA誘導凋亡的關鍵途徑是含半胱氨酸的天門冬氨酸蛋白水解酶途徑(Caspase)與線粒體通路。Sun等[21]將大鼠肝細胞用DON處理48 h，發(fā)現(xiàn)Caspase-3和Caspase-8蛋白水平升高，Caspase-3 mRNA水平升高。此外，王冰潔等[22]研究發(fā)現(xiàn)，ZEA、DON聯(lián)合染毒后，Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-8、Cleaved Caspase-9蛋白的表達量均上升，這與本研究一致，表明DON、ZEA聯(lián)合作用影響仔豬卵巢組織抗氧化水平和線粒體功能，從而進一步導致細胞凋亡程度增加，造成機體損傷；Du等[23]研究發(fā)現(xiàn)，用富氫生理鹽水處理小鼠能夠抑制Caspase-3表達，降低細胞凋亡率。Xie等[24]用甲基苯丙胺腹腔注射5周齡雄性大鼠發(fā)現(xiàn)其Cleaved Caspase-3活性升高，而口服乳果糖后發(fā)現(xiàn)Cleaved Caspase-3活性顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，氫氣通過上調(diào)或下調(diào)凋亡相關因子而發(fā)揮抗細胞凋亡作用[18]。因此在本試驗中，用乳果糖、富氫水處理仔豬后，其產(chǎn)生的氫氣通過下調(diào)Caspase-3表達，從而抑制卵巢組織凋亡。

NO是哺乳動物體內(nèi)一種半衰期極短的信號分子，在維持生殖系統(tǒng)尤其是卵巢的正常生理過程中發(fā)揮重要作用。NOS是NO生產(chǎn)中的關鍵酶。本試驗中，免疫組化結果顯示，3種NOS(nNOS、iNOS、eNOS)在仔豬卵巢不同細胞中特異性表達和定位。這與Ding等[25]的研究結果一致，表明NO和NOS在仔豬卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用；Liang等[26]連續(xù)4 d對小鼠腹腔注射DON與ZEA，發(fā)現(xiàn)其NO水平升高，機體發(fā)生氧化應激損傷。此外，還發(fā)現(xiàn)DON與ZEA表現(xiàn)出協(xié)同效應。NO不僅是一種活性氮自由基，也是一個良好的氧化應激評價指標。NO可以引起氧化反應，改變機體的抗氧化水平。當機體NO水平過高時，就會造成氧化應激和中毒。研究表明，雌激素含量升高時，NO合成以及nNOS表達升高[27]。因此由于ZEA與雌激素結構相似，所以卵巢組織NO含量和NOS活性顯著升高，從而引起抗氧水平改變，最終導致線粒體功能下降和細胞凋亡；有研究報道，富氫鹽液可以通過抑制iNOS酶活性與NO含量來保護大腦[28]。低聚乳果糖可以有效提高患有結腸炎大鼠的抗氧化水平，有效降低iNOS活性和炎性細胞浸潤[29]。本試驗結果與之一致，用乳果糖與富氫水灌胃后，仔豬NO與NOS水平下降。因此可推測，乳果糖與富氫水可以通過降低NO水平來影響抗氧化水平，但是其具體機制還有待進一步研究。

總之，鐮刀菌毒素對斷奶仔豬卵巢抗氧化狀態(tài)具有重要影響，通過影響卵巢NO水平來誘導氧化應激，從而導致線粒體功能下降和細胞凋亡；乳果糖、富氫水能夠緩解仔豬卵巢抗氧化狀態(tài)。但DON、ZEA誘導的氧化應激與NO信號相互關系以及乳果糖和富氫水緩解作用的具體分子機制尚不十分清楚，需要進一步探究。

4 結 論

霉變玉米中的DON與ZEA可能介導仔豬卵巢組織抗氧化水平降低，從而導致細胞凋亡程度加深；而乳果糖與富氫水通過升高抗氧化水平有效緩解DON與ZEA對仔豬卵巢造成的危害。