李小俊，李 欣，陳曉麗，趙毅強(qiáng)，路永強(qiáng)，王 棟*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物學(xué)院，北京100193;3.北京市畜牧總站,北京 100107)

線(xiàn)粒體是細(xì)胞內(nèi)通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生能量的重要細(xì)胞器[1-4]，可根據(jù)內(nèi)外刺激發(fā)生融合、裂變、運(yùn)輸和自噬等復(fù)雜變化[5-7]。哺乳動(dòng)物精子變形過(guò)程中，線(xiàn)粒體在數(shù)量、形狀、結(jié)構(gòu)等方面發(fā)生了顯著變化，線(xiàn)粒體嵴貼附在線(xiàn)粒體外膜內(nèi)側(cè)，增大了線(xiàn)粒體內(nèi)彌散的空泡化基質(zhì)空腔，并最終形成月牙狀的線(xiàn)粒體，螺旋式包裹在精子鞭毛中段，形成線(xiàn)粒體鞘，為精子提供生存、運(yùn)動(dòng)所需的ATP[8-15]，對(duì)精子尾部骨架形態(tài)和功能發(fā)揮重要作用。然而，在精子形成過(guò)程中線(xiàn)粒體鞘形成的調(diào)節(jié)過(guò)程仍有待確定。磷脂酶D家族成員6(Pld6/MitoPld)是物種間保守的磷脂酶D蛋白超級(jí)家族成員，定位于線(xiàn)粒體外膜，可以水解心磷脂(cardiolipin, CL)，產(chǎn)生信號(hào)分子磷脂酸(phosphatidic acid, PA)，誘導(dǎo)線(xiàn)粒體融合[7,16-19]，Pld6缺陷會(huì)導(dǎo)致小鼠線(xiàn)粒體錯(cuò)誤定位于中心體周?chē)?，影響精子形成正常形態(tài)[20]。甘油激酶樣蛋白1(glycerol kinase-like 1, Gykl1)和甘油激酶2(glycerol kinase 2, Gyk2)可以與Pld6相互作用，激活線(xiàn)粒體聚集所依賴(lài)的Pld6和PA,Gykl1和Gyk2缺失會(huì)使Pld6和PA激活受阻，導(dǎo)致精子線(xiàn)粒體形態(tài)異常、線(xiàn)粒體鞘無(wú)序排列和精子尾部缺陷，并使精子ATP的產(chǎn)生失控[21]。由此可見(jiàn)，Pld6對(duì)于小鼠形成正常功能的精子線(xiàn)粒體鞘至關(guān)重要，而該基因在精子形成過(guò)程中的表達(dá)尚不清楚，對(duì)于牛的研究未見(jiàn)報(bào)道。精子線(xiàn)粒體形態(tài)和功能的正常形成，直接影響到種公牛的精液品質(zhì)和精子活力，進(jìn)而影響其繁殖力。本研究在奶牛圓形、長(zhǎng)形精子細(xì)胞和附睪尾精子轉(zhuǎn)錄組研究的基礎(chǔ)上，檢測(cè)了精子變形過(guò)程中3種不同形態(tài)細(xì)胞間差異表達(dá)基因Pld6的表達(dá)水平，并預(yù)測(cè)了牛Pld6蛋白結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步研究該基因在牛精子形成中的重要作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

HistoGene LCM Frozen Section Staining Kit(Life technology)；SG高純總RNA提取試劑盒、Thermo First cDNA Synthesis Kit、2×SG Green qPCR Mix (SinoGene)。

1.2 牛睪丸及附睪組織的采集

選取3頭健康狀況良好、15～17月齡、體況相近、有正常生育能力的荷斯坦公牛，用滅菌手術(shù)剪采集睪丸和附睪組織，分別置于保鮮袋中，標(biāo)注后迅速置于冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牛附睪尾精子的采集及活力檢測(cè) 用手術(shù)剪從睪丸上剝離出附睪尾組織，并置于裝有PBS的RNase-free離心管(50 mL)中，標(biāo)記后剪碎，于4 ℃靜置30 min，使精子從附睪尾中充分游離釋放，小心吸取上清，收集附睪尾精子。取1 μL上述精液，稀釋10倍后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在400×物鏡下統(tǒng)計(jì)直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)的精子占總精子數(shù)量的百分率，以3個(gè)視野的平均數(shù)作為精子活力等級(jí)，活力高于50%的精子用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 牛圓形及長(zhǎng)形精子細(xì)胞的獲取 將新鮮離體睪丸剪成1.0 cm×0.6 cm×0.4 cm的組織塊，用OCT包埋后置于液氮中速凍2～3 min，迅速置于預(yù)冷的-20 ℃冷凍切片機(jī)內(nèi)平衡30 min，將樣品固定后，修片厚度為20 μm，正式切片時(shí)厚度調(diào)為5 μm，用PEN 2.0膜玻片(RNase-free)貼片后，置于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆没蛑苯邮褂迷噭┖腥旧?。然后采用Leica LMD7000系統(tǒng)確認(rèn)染色切片中的圓形、長(zhǎng)形精子細(xì)胞，沿目標(biāo)細(xì)胞邊緣劃線(xiàn)并切割。切割細(xì)胞因自身重力落到含細(xì)胞裂解液的收集管蓋子中，切割完畢后取下收集管，加入75 μL裂解液，按緊蓋子，反復(fù)顛倒2 min，收集細(xì)胞，-80 ℃或液氮保存?zhèn)溆?。每張膜玻片的切割時(shí)間控制在40 min以?xún)?nèi)[22]。

1.3.3 樣本總RNA提取及cDNA合成 參照TRizol使用說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞樣品總RNA，用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度和純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明,以O(shè)ligo(dT)18為引物，將質(zhì)量合格的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3.4 差異基因篩選 通過(guò)RNA-seq對(duì)奶牛圓形、長(zhǎng)形精子細(xì)胞及附睪尾精子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，采用DESeq進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，比較圓形、長(zhǎng)形精子細(xì)胞及附睪尾精子的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并選取|log2Ratio|≥1和q<0.05的基因作為差異表達(dá)基因，利用Blast2GO，得到每個(gè)基因?qū)?yīng)的GO條目，通過(guò)差異基因GO富集分析，得到這些差異基因顯著相關(guān)的生物學(xué)功能，并挑選與線(xiàn)粒體相關(guān)的條目，然后，根據(jù)基因功能篩選差異基因用于qPCR分析。

1.3.5 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)牛Pld6基因的mRNA序列(登錄號(hào)：NM_001271990.1)和beta-肌動(dòng)蛋白基因(β-actin)序列(登錄號(hào)：NM_173979.3)，使用NCBI在線(xiàn)工具設(shè)計(jì)PCR引物。引物信息如表1所示。

表1qPCR引物信息

Table1Theinformationofprimersdesigned

1.3.6 差異基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)分析 以合成的cDNA為模板，按照2×SG Green qPCR Mix反應(yīng)體系，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，使用Excel統(tǒng)計(jì)附睪尾精子及活力；用Prizm4軟件通過(guò)比較Ct方法對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)量分析。使用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著；P<0.01差異極顯著。

1.3.7 Pld6生物信息學(xué)分析 在Uniprot下載牛Pld6蛋白的氨基酸序列，通過(guò)ProtParam軟件(https://web.expasy.org/protparam)分析該蛋白質(zhì)分子組成、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)及穩(wěn)定性等參數(shù)，使用TMHMM軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進(jìn)行跨膜區(qū)域分析，通過(guò)SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) 和Swiss_model軟件(https://www.swissmodel.expasy.org/) 預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)NCBI進(jìn)行BLAST搜索并下載已知同源序列，使用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 奶牛精子細(xì)胞采集

通過(guò)浮游法獲取附睪尾精子，其精子形態(tài)如圖1A所示，其頭部呈橢圓形，輪廓規(guī)則，幾乎看不到畸形精子?；盍y(tǒng)計(jì)結(jié)果：1、2、3號(hào)樣品的精子數(shù)分別為1.28×109、1.58×109、1.24×109，其中，直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)精子占精子總數(shù)的百分率分別為54%、55%、61%，可以用于后續(xù)研究。

奶牛睪丸組織冰凍切片染色后，顯微鏡下可見(jiàn)圓形精子細(xì)胞(圖1B)，細(xì)胞核偏向細(xì)胞一側(cè)或居中；長(zhǎng)形精子細(xì)胞呈長(zhǎng)條狀、兩頭鈍圓(圖1D)。LCM切割前圓形精子細(xì)胞見(jiàn)圖1B(箭頭指出并紅色圈出的細(xì)胞)；LCM切割后的圓形精子細(xì)胞見(jiàn)圖1C；LCM切割前長(zhǎng)形精子細(xì)胞見(jiàn)圖1D(箭頭指向并綠色圈出的細(xì)胞)；LCM切割后的長(zhǎng)形精子細(xì)胞見(jiàn)圖1E，細(xì)胞樣品收集情況見(jiàn)圖1F和表2。

2.2 奶牛圓形、長(zhǎng)形精子細(xì)胞及附睪尾精子總RNA的制備及含量分析

表3顯示，所有細(xì)胞樣本總RNA的OD260 nm/OD280 nm為1.91～1.98，純度較高。圓形精子細(xì)胞總RNA量為2 000～2 650 ng，長(zhǎng)形精子細(xì)胞總RNA量為2 700～3 200 ng，而附睪尾精子總RNA含量為2 300～3 700 ng。

A. 普通光學(xué)顯微鏡下附睪尾精子形態(tài)(200×);B.切割前圓形精子細(xì)胞(箭頭指出并紅色圈出的細(xì)胞)(400×)；C.切割后圓形精子細(xì)胞(與圖B對(duì)應(yīng)圈出的細(xì)胞)(400×)；D.切割前長(zhǎng)形精子細(xì)胞(箭頭指出并綠色圈出的細(xì)胞)(400×)；E.切割后長(zhǎng)形精子細(xì)胞(與圖D對(duì)應(yīng)圈出的細(xì)胞)(400×);F.激光顯微切割儀切割后收集到的細(xì)胞(150×)A. Sperm morphology of epididymis tail under general optical microscope(200×)； B.Photo before cutting round spermatids (the arrows point and circle the cells in red) under the microscope of LCM(400×)；C.Photo after cutting round spermatids under the microscope of LCM(the corresponding cells to figure B circled)(400×)；D.Photo befor cutting elongated spermatids (the arrows point and circle the cells in green) under the microscope of LCM(400×)；E.Photo after cutting elongated spermatids (the corresponding cells to figure D circled) under the microscope of LCM(400×)；F.The collected spermatids under the microscope of LCM(150×)圖1 精子細(xì)胞的獲取Fig.1 Collection of spermatogenic cells

表2收集到的圓形及長(zhǎng)形精子細(xì)胞數(shù)

Table2Thenumberofroundandelongatedspermatids

樣本Sample圓形精子細(xì)胞數(shù)(R)Round spermatids No.長(zhǎng)形精子細(xì)胞數(shù)(E)Elongated spermatids No.16 1886 02926 0596 122310 25710 551

表3總RNA濃度檢測(cè)

Table3TheconcentrationdetectionofRNA

細(xì)胞類(lèi)型Cell typeRNA濃度/(ng·μL-1)ConcentrationRNA體積/μLVolumeRNA吸光度比值OD260 nm/OD280 nm總RNA量/ngTotal RNA quantityR151501.942 550240501.922 000353501.912 650E164501.963 200259501.972 950354501.982 700M148501.972 400274501.973 700346501.952 300

R.圓形精子細(xì)胞；E.長(zhǎng)形精子細(xì)胞；M.附睪尾精子。1、2、3分別為3類(lèi)細(xì)胞的生物學(xué)重復(fù)

R. Round spermatid; E. Elongated spermatid;M. Epididymal sperm.1,2,3. The 3 biological duplication of 3 cell types

2.3 差異基因篩選

通過(guò)DESeq進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，共發(fā)現(xiàn)5 349個(gè)基因在精子形成階段差異表達(dá)(|log2Ratio|≥1，q<0.05)，其中，圓形到長(zhǎng)形精子的差異表達(dá)基因?yàn)?94個(gè)(246個(gè)上調(diào)，748個(gè)下調(diào))；長(zhǎng)形到附睪尾精子差異表達(dá)基因?yàn)? 771個(gè)(1 613個(gè)上調(diào)，3 158個(gè)下調(diào))，根據(jù)基因注釋?zhuān)瑢⑦@些基因進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)了與線(xiàn)粒體及精子變形相關(guān)的功能條目及差異基因(表4)，其中，Pld6在圓形、長(zhǎng)形和附睪尾精子中的表達(dá)量(FPKM值)分別為492.00、1 870.67和0.00，即在圓形變形為長(zhǎng)形精子細(xì)胞的過(guò)程中表達(dá)量升高，為圓形精子細(xì)胞的3.8倍，而在附睪尾精子中表達(dá)量降低為0，且該基因富集于線(xiàn)粒體融合(mitochondrial fusion)功能條目中，根據(jù)其測(cè)序數(shù)據(jù)及注釋的重要功能，篩選該基因進(jìn)行后續(xù)分析研究。

表4與線(xiàn)粒體相關(guān)的功能條目及富集的基因數(shù)

Table4Mitochondrial-relatedGOtermsandenrichedgenenumber

GO條目GO term功能描述Description差異基因數(shù)Gene numberGO:0007005線(xiàn)粒體組織Mitochondrion organization99GO:0008053線(xiàn)粒體融合Mitochondrial fusion8GO:0000422線(xiàn)粒體降解Mitochondrion degradation24GO:0007007線(xiàn)粒體內(nèi)膜Inner mitochondrial membrane organization4GO:0051646線(xiàn)粒體定位Mitochondrion localization5GO:0007006線(xiàn)粒體膜Mitochondrial membrane organization14GO:0042775線(xiàn)粒體ATP合成耦合電子傳遞Mitochondrial ATP synthesis coupled electron transport16GO:0000266線(xiàn)粒體分裂Mitochondrial fission13

2.4 Pld6在奶牛圓形、長(zhǎng)形精子細(xì)胞和附睪尾精子中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)檢測(cè)

Pld6基因的qPCR檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示，Pld6基因在圓形到長(zhǎng)形精子細(xì)胞期間表達(dá)量升高，而在后期的精子成熟過(guò)程中表達(dá)量降低，與測(cè)序數(shù)據(jù)一致。

2.5 Pld6蛋白的特征分析

ProtParam分析表明，Pld6蛋白由220個(gè)氨基酸組成，分子式為C1128H1799N331O306S8，相對(duì)分子質(zhì)量為25 150.21，理論等電點(diǎn)為9.77，不穩(wěn)定指數(shù)為61.43，屬于不穩(wěn)定蛋白。通過(guò)SOPMA對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，該蛋白含有39.55%α螺旋，29.09%隨機(jī)卷曲，20.91%延伸鏈，10.45%β折疊(圖3)，TMHMM對(duì)其跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，第1～9氨基酸位于膜外，10～32氨基酸是跨膜區(qū)域，33～220氨基酸位于膜內(nèi)，其中跨膜區(qū)域?yàn)樵摰鞍自诰€(xiàn)粒體外膜定位區(qū)域(圖略)。對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖4)，α螺旋區(qū)域位于外圍，β折疊區(qū)域被α螺旋區(qū)域包圍在內(nèi)側(cè)，呈喇叭狀。

R．圓形精子細(xì)胞；E．長(zhǎng)形精子細(xì)胞；M．附睪尾精子。標(biāo)有不同大寫(xiě)字母和不同小寫(xiě)字母者分別表示組間差異極顯著和差異顯著(P<0.01,P<0.05)R．Round spermatid; E．Elongated spermatid; M．Epididymal sperm.Those marked with different capital letters and different lowercase letters respectively indicate extremely significant differences (P<0.01) and significant differences (P<0.05) among different groups圖2 精子變形期間Pld6基因qPCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Relative expression of Pld6 gene during spermiogenesis

2.6 奶牛Pld6蛋白同源性及進(jìn)化分析

利用NCBI的BLASTp對(duì)牛Pld6進(jìn)行同源搜索，結(jié)果表明，牛(Bostaurus)與小鼠(Musmusculus)、黑猩猩(Pantroglodytes)、人(Homosapiens)、光滑爪蟾(Xenopuslaevis)、非洲爪蟾(Xenopustropicalis)和斑馬魚(yú)(Daniorerio)的同源性分別為85%、85%、84%、60%、60%和55%。用DNAMAN對(duì)下載蛋白序列的多重比對(duì)(圖5)發(fā)現(xiàn)，這些蛋白有一個(gè)明顯的Pld家族區(qū)域H(X)K(X4)D (HKD)，是該蛋白的活性區(qū)域。對(duì)這7個(gè)蛋白建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖6)，Pld6進(jìn)化分為魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)和哺乳類(lèi)3個(gè)分支，符合動(dòng)物分類(lèi)學(xué)地位。

藍(lán)色.α螺旋；綠色.β折疊；紅色.延伸鏈；紫色.隨機(jī)卷曲Blue.Alpha helix; Green. Beta sheet; Red. Extended strand; Purple.Random coil圖3 Pld6蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Secondary structure prediction of Pld6 protein

A.α螺旋；B.β折疊；C.延伸鏈；D.隨機(jī)卷曲A.Alpha helix; B. Beta sheet; C. Extended strand; D. Random coil圖4 Pld6蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 Prediction of tertiary structure of Pld6 protein

3 討 論

結(jié)構(gòu)是正常功能充分發(fā)揮的基礎(chǔ)，精子變形期間尾部正常結(jié)構(gòu)的形成，對(duì)精子活力及受精能力形成具有重要作用[13-15,22-24]，本研究通過(guò)對(duì)精子形成過(guò)程中大量基因的差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)了與精子尾部中段線(xiàn)粒體分布和形態(tài)結(jié)構(gòu)相關(guān)的Pld6基因，又利用后續(xù)qPCR結(jié)果驗(yàn)證了其差異表達(dá)的真實(shí)性，并通過(guò)對(duì)該蛋白可能的結(jié)構(gòu)和功能分析，對(duì)該基因與精子尾部結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系進(jìn)行了科學(xué)推斷。

哺乳動(dòng)物精子形成過(guò)程中，精子細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了復(fù)雜變化[8-12]，為探究精子變形的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)奶牛圓形、長(zhǎng)形精子細(xì)胞及附睪尾精子進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，Pld6基因在圓形到長(zhǎng)形精子細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量升高，在附睪尾精子中未檢測(cè)到其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，通過(guò)GO分析，將該基因富集在mitochondrial fusion條目。研究表明，線(xiàn)粒體形態(tài)通過(guò)線(xiàn)粒體融合和裂變的動(dòng)態(tài)平衡維持，Pld6基因參與該平衡的維持[25-26]，可能影響精子尾部特異的線(xiàn)粒體鞘形態(tài)的形成和維持。而Pld6激活失敗或缺陷會(huì)使小鼠線(xiàn)粒體錯(cuò)誤定位于中心體周?chē)?，?dǎo)致精子形成停滯，或使精子線(xiàn)粒體形態(tài)異常、線(xiàn)粒體鞘無(wú)序排列和精子尾部缺陷[20-21]，因此，推測(cè)該基因還對(duì)牛精子線(xiàn)粒體鞘形成發(fā)揮重要作用。而目前尚未見(jiàn)到對(duì)牛Pld6功能的研究，為進(jìn)一步探索該基因功能，本研究對(duì)牛Pld6蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白在不同物種間具有保守的H(X)K(X4)D (HKD)結(jié)構(gòu)域，并呈現(xiàn)酶活性區(qū)域特征，推測(cè)在圓形精子向長(zhǎng)形精子發(fā)育過(guò)程中，Pld6基因表達(dá)產(chǎn)物可通過(guò)該功能域催化CL產(chǎn)生PA，并進(jìn)一步通過(guò)該信號(hào)分子，誘導(dǎo)精子細(xì)胞線(xiàn)粒體向尾部中段聚集和相互融合，促進(jìn)了精子尾部特異形狀和功能的形成，該推斷可通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)[7,27-29]得到驗(yàn)證。研究表明，小鼠Pld6定位于線(xiàn)粒體外膜[20,30]，其三級(jí)結(jié)構(gòu)呈喇叭狀，該蛋白活性區(qū)域?yàn)棣抡郫B，處于喇叭狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部[31]，這與本研究預(yù)測(cè)的牛Pld6蛋白結(jié)構(gòu)相似。同時(shí)，本研究關(guān)于該基因蛋白序列同源物種的聚類(lèi)分析表明，該蛋白通過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化，已分化為魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)和哺乳類(lèi)3個(gè)進(jìn)化方向，其中，牛與小鼠關(guān)于Pld6蛋白具有最接近的進(jìn)化趨勢(shì)。聚類(lèi)分析結(jié)果為將來(lái)采用比較組學(xué)技術(shù)，充分利用小鼠研究成果，指導(dǎo)牛上深入開(kāi)展該基因及蛋白在精子形成中對(duì)線(xiàn)粒體鞘形成的作用提供一定的理論基礎(chǔ)，對(duì)提高種公牛繁殖力有積極意義。

圖5 不同物種Pld6蛋白序列比對(duì)結(jié)果Fig.5 The sequence alignment of Pld6 protein among different species

圖6 Pld6蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of Pld6 protein

4 結(jié) 論

本研究根據(jù)小鼠研究推斷牛精子變形過(guò)程中，Pld6基因表達(dá)增多可誘導(dǎo)線(xiàn)粒體向精子細(xì)胞尾部中段聚集，促進(jìn)了線(xiàn)粒體鞘的正常形成，對(duì)確保牛精子活力及受精能力具有重要作用，為進(jìn)一步研究Pld6基因功能，提供了重要基礎(chǔ)。關(guān)于Pld6基因的表達(dá)調(diào)控及其產(chǎn)物對(duì)精子中線(xiàn)粒體形態(tài)形成和功能發(fā)揮的作用，還需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。