李艷梅，江忠勇，李志強(qiáng)

目前在我國臨床分子診斷學(xué)中，診斷項(xiàng)目主要為感染性疾病病原體核酸的擴(kuò)增檢測，如乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、人類免疫缺陷病毒(HIV)等，采用的方法基本上都是實(shí)時熒光定量PCR。雖然PCR技術(shù)在我國各個臨床實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)用極其廣泛和成熟，但仍然不同于臨床生化、血液等其他學(xué)科在標(biāo)準(zhǔn)化管理上有一套普遍認(rèn)可的完整的管理體系，這就使得各個實(shí)驗(yàn)室的操作管理系統(tǒng)存在很大的差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可能相差甚遠(yuǎn)[1]。ISO15189和美國病理學(xué)家學(xué)會（CAP）認(rèn)可要求中規(guī)定，在開展某一檢測項(xiàng)目前，需進(jìn)行方法學(xué)性能驗(yàn)證[2-3]。為了保證PCR實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的準(zhǔn)確性，規(guī)范實(shí)驗(yàn)室操作流程，本研究以血清HBV-DNA檢測為例，對PCR定量檢測系統(tǒng)的性能驗(yàn)證方法進(jìn)行分析，擬為建立有關(guān)性能驗(yàn)證的SOP提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 2017年1～12月臨床需要行HBV檢測患者的送檢全血標(biāo)本，在采集后2 h內(nèi)分離血清，并于當(dāng)天檢測或于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑 Bio-Rad CFX96實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增儀，低速瞬離器、經(jīng)校準(zhǔn)合格的各類加槍；HBV定量檢測試劑（湖南圣湘生物科技有限公司，批號2017020）及其配套的定值血清和質(zhì)控品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 精密度 依據(jù)CLSI EP15-2，選擇HBVDNA濃度在廠家聲明檢測范圍內(nèi)的臨床送檢標(biāo)本，每天1個分析批次、2個水平濃度，每一水平濃度重復(fù)測定3次，連續(xù)檢測5 d，每個水平濃度累計(jì)得到15個結(jié)果。分別計(jì)算兩個水平濃度的重復(fù)性精密度（CV批內(nèi)）和中間精密度（CV批間）。 判讀標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T214中的規(guī)定，方法精密度的重復(fù)性限為CV＜5%；以能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評評價界限（靶值的對數(shù)值±0.4）作為允許總誤差TEa，CV批內(nèi)＜3/5TEa且CV批間＜4/5TEa為符合要求。

1.3.2 準(zhǔn)確度 選擇代表方法可報(bào)告范圍中的高、低決定性濃度的廠家定值血清標(biāo)本，每天各重復(fù)2次測定，檢測5 d，每個濃度測定累計(jì)得到10個檢測結(jié)果。判讀標(biāo)準(zhǔn)：|log檢測值-log定值|≤0.4（能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評）且 CV＜5%（國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T214中關(guān)于方法精密度的重復(fù)性限的規(guī)定）為合格。

1.3.3 線性范圍 依據(jù)CLSI EP6文件，以HBVDNA濃度為4.6×106IU/ml的定值血清為母液，用HBV-DNA檢測陰性且外觀正常的血清進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋，直至低于廠家聲明線性下限的一個濃度梯度（4.6×10、4.6×102、4.6×103、4.6×104、4.6×105、4.6×106IU/ml），每個濃度檢測3次取均值。以理論值與實(shí)測值作線性回歸分析，得出相關(guān)系數(shù)和線性范圍，R2≥0.98為符合要求（廠家聲明）。

1.3.4 檢測下限 以廠家提供的HBV-DNA陽性定值血清為母液，用正常混合血清稀釋至廠家聲明的檢測下限后，重復(fù)檢測10次，以檢測出≥9次為符合要求。

1.3.5 檢測下限灰區(qū)標(biāo)本的非特異性擴(kuò)增 在對HBV-DNA高值母液血清標(biāo)本稀釋為10～100 IU/ml的標(biāo)本中，選取兩份分別完成15次檢測。分析每次反應(yīng)曲線的起跳情況，計(jì)算起跳率（需≥95%）。準(zhǔn)確性判斷標(biāo)準(zhǔn)：|log靶值-log檢測值|＜0.8，即判讀標(biāo)準(zhǔn)完成結(jié)果的正確性＞50%。

1.4 檢驗(yàn)程序質(zhì)量保證

1.4.1 人員 由取得PCR上崗證的操作人員進(jìn)行操作。

1.4.2 質(zhì)控和溯源性 試驗(yàn)過程均跟陰陽對照、校準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)定值血清，根據(jù)Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法，判斷當(dāng)次質(zhì)控結(jié)果是否在控，如失控則重新檢測。所用的標(biāo)準(zhǔn)定值血清為二級標(biāo)準(zhǔn)，溯源于國家一級標(biāo)準(zhǔn)品。本實(shí)驗(yàn)室參加2017年原國家衛(wèi)計(jì)委臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評，結(jié)果通過。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有檢測濃度先行以10為底的log轉(zhuǎn)換后，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。一致性檢驗(yàn)采用配對t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精密度 HBV-DNA定量檢測低、高值的CV批內(nèi)分別為 1.47%和 0.79%，CV批間分別為 2.09%和0.995%，精密度驗(yàn)證通過（表1）。

2.2 準(zhǔn)確度 HBV-DNA定量低、高值的定值血清標(biāo)本檢測結(jié)果中，CV值分別為3.59%和1.58%，準(zhǔn)確度驗(yàn)證通過（表2）。

2.3 線性范圍 本試驗(yàn)6個濃度梯度的線性回歸分析R2=0.9623（P＜0.98），去掉最低濃度梯度后，回歸方程為：y=1.005x-0.2633，R2=0.9991 （P＞0.98），證實(shí)檢測系統(tǒng)在（4.6×102～4.6×106）IU/ml范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（圖 1），在廠家聲明的線性范圍（1×102～5×109IU/ml）內(nèi)。

圖1 線性范圍驗(yàn)證回歸曲線

2.4 檢測下限 廠家聲明的HBV-DNA檢測下限為100 IU/ml，在此濃度10例標(biāo)本全部檢出，大于最低要求的9例，檢測下限驗(yàn)證符合廠家聲明。

2.5 檢測下限灰區(qū)標(biāo)本的非特異性擴(kuò)增 在兩份灰區(qū)標(biāo)本共計(jì)30次檢測結(jié)果中，所有反應(yīng)均起跳，起跳率100%（＞95%），正確性符合率分別為53.33%和66.67%（＞50%），未在兩份稀釋血清標(biāo)本中檢測到非特異性擴(kuò)增。

表1 HBV-DNA檢測精密度評價結(jié)果

表2 HBV-DNA檢測準(zhǔn)確度評價結(jié)果

3 討論

本研究參照文獻(xiàn)方法及相關(guān)管理體系文件的建議[4-8]，設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。對定量的分子檢測技術(shù)而言，目前尚沒有統(tǒng)一的國際參考標(biāo)準(zhǔn)來確定什么樣的精密度是可被臨床診斷實(shí)驗(yàn)室所普遍接受的，一般試劑盒廠家所聲明的范圍，是本實(shí)驗(yàn)室工作參照的最低標(biāo)準(zhǔn)。在此基礎(chǔ)之上，可以參照國內(nèi)外相關(guān)的其他權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)，以此運(yùn)用于自己的實(shí)驗(yàn)室。

根據(jù)《臨床檢驗(yàn)方法確認(rèn)與性能驗(yàn)證》中“如何驗(yàn)證廠家的聲明”的相關(guān)方案[10]，本實(shí)驗(yàn)參照能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評評價標(biāo)準(zhǔn)來評價正確度。在方法“1.3.2”中，本研究在正確度的試驗(yàn)結(jié)果上，加入精密度的判斷標(biāo)準(zhǔn)以完成對準(zhǔn)確度的判讀。可見，準(zhǔn)確度包括正確度和精密度。

分子檢測技術(shù)的分析測量范圍是一個鑒別實(shí)時定量PCR效率的重要指標(biāo)，目前還沒有一個標(biāo)準(zhǔn)化的方法來鑒別。最常用的方法是成倍或?qū)?shù)梯度稀釋參考物或已知陽性的靶核酸標(biāo)本，核酸的梯度最少應(yīng)有5個以上的測定梯度點(diǎn)來確定。由于高濃度臨床標(biāo)本較難獲得，本試驗(yàn)選用廠家提供的高濃度定值血清為母液，進(jìn)行多梯度點(diǎn)的稀釋。通過各個梯度點(diǎn)實(shí)測值與理論值的線性回歸分析，以證明該P(yáng)CR檢測技術(shù)符合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所達(dá)到的設(shè)計(jì)要求。對HB-DNA定量檢測而言，是否檢出核酸是判斷HBV是否處于復(fù)制狀態(tài)的一項(xiàng)指標(biāo)，所以，定量檢出下限的驗(yàn)證也是性能驗(yàn)證中不可缺少的一項(xiàng)。本實(shí)驗(yàn)增加了對檢測下限灰區(qū)標(biāo)本的擴(kuò)增情況分析，結(jié)果表明，本系統(tǒng)所用試劑盒在灰區(qū)濃度的檢測具有較好的靈敏性和穩(wěn)定性。

關(guān)于分子檢測系統(tǒng)的性能驗(yàn)證內(nèi)容，其他參考文獻(xiàn)還提到分析靈敏度、特異性（交叉反應(yīng)性和抗干擾能力）、分子檢測方法臨床驗(yàn)證、核酸提取效率（完整性、產(chǎn)率與純度）等[11]。本實(shí)驗(yàn)的核酸擴(kuò)增效率均在90%～110%之間，但由于設(shè)備、試劑成本等多因素的限制，未能進(jìn)行上述所有項(xiàng)目的驗(yàn)證，而所完成的項(xiàng)目是在諸多PCR熒光定量性能驗(yàn)證相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的。結(jié)果證明，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案可以運(yùn)用于臨床檢驗(yàn)工作中，能滿足預(yù)期臨床檢測要求，也可為本實(shí)驗(yàn)室建立有關(guān)性能驗(yàn)證SOP提供依據(jù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)室HBV-DNA檢測系統(tǒng)性能符合要求，設(shè)計(jì)的性能驗(yàn)證方法可行性好，可為建立有關(guān)系統(tǒng)性能驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP）提供參考依據(jù)。