曾 敏

癌癥因其高致死率，一直以來(lái)嚴(yán)重威脅著人類健康，傳統(tǒng)手術(shù)切除治療方法很難根治，隨后采取的放化療手段又給患者帶來(lái)巨大痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，乳腺癌患者大多接受切除手術(shù)和化療結(jié)合的治療方案，能夠取得一定的預(yù)期療效[8]。但是，一旦發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，尤其是肺轉(zhuǎn)移后，傳統(tǒng)的治療方案效果欠佳，病死率很高。因此，尋找新的靶向低毒的抗轉(zhuǎn)移藥物已成為治療晚期乳腺癌轉(zhuǎn)移的研究熱點(diǎn)之一。和厚樸酚（honokiol）是從木蘭科植物厚樸中提取分離得到，具有較好的抗炎、抗菌、抗衰老和抑制腫瘤生長(zhǎng)等作用[9]。因其為天然植物提取成分，相對(duì)合成化合物具有低毒、安全的優(yōu)點(diǎn)，也越來(lái)越受人們關(guān)注。本課題組在體外研究中發(fā)現(xiàn)，其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有較好的抑制作用。為此，本研究通過(guò)建立小鼠4T1肺轉(zhuǎn)移模型，以考察其對(duì)乳腺癌晚期肺轉(zhuǎn)移模型的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料 和厚樸酚（由本課題組分離提取，經(jīng)HPLC檢測(cè)含量＞98%）；紫杉醇（四川太極制藥有限公司）；4T1、B16F10、H460、H1975 細(xì)胞株（美國(guó) ATCC細(xì)胞庫(kù)，由本課題組保種）；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶消化液、青霉素、鏈霉素（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清（草原綠野生物制品有限公司）；MTT（美國(guó) Sigma 公司）；Cleaved-Caspase3（美國(guó) abcam 公司）；Balb/c小鼠，SPF 級(jí)， 雌性，18～20 g（北京華阜康生物科技股份有限公司），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（京）2014-0004。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 4T1、H460、H1975細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，B16F10細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h傳代一次。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化液消化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞半抑制率（IC50）測(cè)定 分別取4T1、B16F10、H460、H1975細(xì)胞懸液，按 3×104個(gè)/ml細(xì)胞密度鋪96孔板，每孔 100 μl，正常培養(yǎng) 24 h。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組和和厚樸酚給藥組：給藥組加入終濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μM/L 的和厚樸酚， 空白對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。用Graph Pad Prism6.0軟件計(jì)算IC50，考察不同時(shí)間點(diǎn)和厚樸酚對(duì)細(xì)胞的抑制作用（n=6）。

1.2.3 Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)測(cè)定 取4T1細(xì)胞懸液，按3×105個(gè)/ml細(xì)胞密度鋪6孔板，每孔2 ml，正常培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、陽(yáng)性藥組和和厚樸酚給藥組：陽(yáng)性藥組給予紫杉醇10 nM/L；和厚樸酚給藥組給予不同濃度和厚樸酚（0.4、0.8、1.6 μM/L）；溶劑對(duì)照組給予同體積的空白溶劑；空白對(duì)照組不做處理。作用48 h后，提取總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定細(xì)胞的蛋白濃度。采用免疫印跡法（Wetern blotting）檢測(cè) Cleaved-Caspase3蛋白[3-4]的表達(dá)水平[1-2]。實(shí)驗(yàn)步驟：每組取25 μg蛋白樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4℃孵育（1∶1000）過(guò)夜，用 TBST 洗膜 2 次；換二抗（1∶2000）室溫孵育2 h，用TBST洗膜2次后，用化學(xué)發(fā)光顯色試劑顯影并采集圖像進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)采用GAPDH為內(nèi)參。

1.2.4 肺轉(zhuǎn)移模型建立 取4T1細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至 2.5×105個(gè)/ml。 按 100 μl/鼠尾靜脈接種[5]，次日開始分組給藥。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組和和厚樸酚給藥組，每組10只小鼠：空白對(duì)照組給予生理鹽水200 μl灌胃，1次/d；和厚樸酚給藥組給予和厚樸酚溶液 200 μl（200 mg/kg）灌胃，1 次/d。 每日觀察小鼠狀態(tài)，并記錄生存結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用One-way ANOA方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IC50測(cè)定結(jié)果 和厚樸酚對(duì)各腫瘤細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用，且隨作用時(shí)間延長(zhǎng)IC50也隨之降低（P＜ 0.05，表 1）。

表1 和厚樸酚對(duì)細(xì)胞增殖的影響(n=6)

2.2 和厚樸酚對(duì)4T1細(xì)胞Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，0.4、0.8、1.6 μM/L的和厚樸酚作用48 h，能明顯增加細(xì)胞Cleaved-Caspase3蛋白的表達(dá)，且強(qiáng)于陽(yáng)性藥紫杉醇組，而溶劑對(duì)照組Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯變化。見(jiàn)圖1。

圖1 各組4T1細(xì)胞Cleaved-Caspase3表達(dá)結(jié)果比較

2.3 生存率考察結(jié)果 在接種4T1細(xì)胞后，空白對(duì)照組在接種第10 d時(shí)便開始有小鼠死亡，且在第14 d后小鼠開始死亡增多，第18 d時(shí)已無(wú)小鼠存活。與空白對(duì)照組比較，和厚樸酚給藥組在接種第24 d時(shí)才有1只小鼠死亡，第40 d后小鼠開始陸續(xù)死亡，中位生存期為58 d（圖2）。

圖2 和厚樸酚對(duì)乳腺癌4T1細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型小鼠生存率的影響

3 討論

近年來(lái)，中藥活性成分用于抗腫瘤的研究日益增多，因其低毒、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)而廣受青睞。和厚樸酚作為常用中藥厚樸的有效成分，其來(lái)源較廣，獲得相對(duì)容易，且藥理作用面較廣，具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。由本研究結(jié)果（表1）可以看出，和厚樸酚對(duì)幾株腫瘤細(xì)胞的IC50均小于30 μM/L（72 h），表現(xiàn)出良好的抑制效果。表明和厚樸酚對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，且對(duì)人源（H460、H1975）和鼠源（4T1、B16F10）細(xì)胞珠均有較好抑制作用，并存在一定的時(shí)間依賴關(guān)系。免疫印跡結(jié)果（圖1）也表明，和厚樸酚對(duì)凋亡促進(jìn)相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase3的表達(dá)有明顯上調(diào)作用，提示其能有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[7]。

在癌癥發(fā)展過(guò)程中，晚期患者常會(huì)出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的情況，從而導(dǎo)致病情進(jìn)一步惡化，給患者和治療帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。本研究通過(guò)尾靜脈接種乳腺癌4T1細(xì)胞，入血后會(huì)自發(fā)轉(zhuǎn)移至肺部，來(lái)模擬乳腺癌晚期肺轉(zhuǎn)移情況[10]。結(jié)果接種后，未經(jīng)藥物治療的小鼠會(huì)很快死亡（空白對(duì)照組小鼠中位生存期僅為18 d），解剖后可發(fā)現(xiàn)小鼠肺部有大量4T1細(xì)胞聚集。給藥組通過(guò)200 mg/kg劑量的和厚樸酚干預(yù)治療，與空白對(duì)照組比較，小鼠開始出現(xiàn)死亡和無(wú)小鼠存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，中位生存期達(dá)58 d，表明和厚樸酚對(duì)小鼠肺轉(zhuǎn)移模型有較好的治療效果。

綜上所述，和厚樸酚能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)有較好抑制作用，具有較大的開發(fā)利用價(jià)值。