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(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 貴陽 550006)

茶樹(Camelliasinensis)為重要經(jīng)濟飲料作物，是世界3種無酒精飲料主要作物之一。茶樹為雌雄同株且自交親和性低的一種蟲媒植物，由于茶樹本身特性、開花季節(jié)、環(huán)境和花粉活力等因素的影響，茶樹結(jié)實率往往較低[1]，而較低的結(jié)實率會影響育種效率。福鼎大白茶(C.sinensiscv.Fuding-dabaicha)是國家級優(yōu)良茶樹品種之一，往往被作為雜交育種的優(yōu)良親本材料，目前利用福鼎大白茶作為親本選育的優(yōu)良品種有福云6號、福云7號、黔湄809、鄂茶1號等[2]。

花粉作為父本遺傳信息傳遞的載體，是雜交育種實施的基本材料[3-4]。常規(guī)育種常會遇到氣候不宜、不同品種花期不遇或雄性不育等問題[5]。因此，測定花粉活力，對于茶樹雜交育種中的人工授粉、花期不遇的解決具有重要意義。

目前，對茶樹花粉活力研究已有報道，如陳暄等[1]以龍井長葉花粉為材料，得到花粉最適的培養(yǎng)基為0.01%(100 mg/L)H3BO3+0.05%(500 mg/L)Ca(NO3)2+5%PEG-4 000+5%麥芽糖，25 ℃恒溫培養(yǎng)1 h，萌發(fā)率為82.24%，花粉管生長長度為492μm；楊盛美等[6]以100 g/L蔗糖+1%瓊脂的固體培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)4 h，研究了10個茶種花粉的萌發(fā)率為9.2%～79.1%；許林等研究認(rèn)為，臺茶12號和福鼎大白茶的花粉離體萌發(fā)的最適培養(yǎng)基及條件是300 mg/L Ca(NO3)2+200 mg/L MgSO4+100 mg/L KNO3+100 mg/L H3BO3+10%蔗糖+1%瓊脂，最適pH值為5.4，適宜萌發(fā)溫度16～21 ℃培養(yǎng)24 h[7]。這些研究都是用離體萌發(fā)法測定花粉活力，因為品種不同，培養(yǎng)基組分差異等原因，所得結(jié)果則不盡相同。茶樹花粉活力少見有染色法測定茶樹花粉活力的報道。染色法是一種快速檢測花粉活力的方法，為提高雜交育種結(jié)實率，雜交育種前對花粉活力的快速檢測尤其重要?；ǚ垭x體萌發(fā)法是測定花粉活力最直觀可靠的方法，本研究以福鼎大白茶花粉為材料，考慮不同濃度的蔗糖、硼酸、硝酸鈣，采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化茶樹花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基；通過離體萌發(fā)法、TTC染色法的對比，探討茶樹花粉活力的快速測定方法。對茶樹花粉的活力進行系統(tǒng)研究，以期建立有效、快速的花粉活力檢測方法，為后期開展茶樹花粉貯藏活力檢測和雜交育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶樹種質(zhì)資源圃的5年生福鼎大白茶為研究對象，取其新鮮花粉作為試驗材料。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設(shè)計

2017年11月，以福鼎大白茶花粉為材料，考慮不同濃度的蔗糖、硼酸、硝酸鈣，采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化茶樹花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基；通過離體萌發(fā)法、TTC染色法的對比，探討茶樹(C.sinensis)花粉活力的快速測定方法。選擇晴天09：00～11：00時，采集生長發(fā)育良好、含苞待放的花朵，及時攤放在陰涼干燥處，待24 h后花粉成熟時，輕輕打開花瓣，將花粉從花朵上輕輕抖落在硫酸紙上，除去雜質(zhì)，放入棕色玻璃瓶中并充分振蕩搖勻，用封口膜密封，貯藏于4 ℃冰箱備用。試驗溶液均用蒸餾水配制，其濃度均為終濃度，配制溶液的pH值均為5.5±0.1，每處理均制作4個玻片，即4個重復(fù)。

試驗一：花粉離體萌發(fā)法[8]

采用L9(34)正交試驗篩選花粉離體萌發(fā)條件(表1)，以期篩選出最優(yōu)的離體萌發(fā)條件。

表1 茶樹花粉離體萌發(fā)正交試驗設(shè)計因素和水平

水平因素蔗糖(g/L)硼酸(mg/L)硝酸鈣(mg/L)110010010021501501503200200200

試驗二：氯化三苯基四氮唑(TTC)法[9]

采用2.5，5，10 g/L(m/v)3種濃度，以期篩選出最優(yōu)的TTC染色法。

1.2.2 培養(yǎng)方法

試驗一采用凹槽載玻片，不需加蓋蓋玻片。試驗二使用的是光片載玻片，且制片時需要加蓋蓋玻片。往載玻片滴一小滴配制溶液，用牙簽挑取少許花粉，輕拍手腕，將花粉抖落于培養(yǎng)基表面，當(dāng)其表面呈微黃色即可。將制好的玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 觀 測

試驗一：培養(yǎng)24 h后用顯微鏡(尼康 Nikon ECLIPSE 80 i，日本生產(chǎn)，下同)觀察花粉萌發(fā)情況，放大倍數(shù)為100倍，每個載玻片隨機選取5個視野(每個視野花粉在100粒以上)，統(tǒng)計每個視野花粉粒總數(shù)和萌發(fā)的花粉數(shù)，花粉萌發(fā)以花粉管長度大于花粉直徑為標(biāo)準(zhǔn)；每個視野隨機抽取10粒已萌發(fā)的花粉，測定花粉管長度。試驗二：每隔30 min用顯微鏡觀察花粉活力，放大倍數(shù)為100倍，每個載玻片隨機選取5個視野(每個視野花粉在100粒以上)，染為紅色的花粉活力強，淡紅色的次之，無色者為沒有活力的花粉或不育花粉。預(yù)試驗觀察發(fā)現(xiàn)，2 h后染為紅色和淡紅色的花粉數(shù)量基本穩(wěn)定，則試驗2 h后停止觀察，統(tǒng)計時將染為紅色和淡紅色的花粉計為有活力花粉。

1.3 數(shù)據(jù)處理

計算每個視野有活力的花粉粒數(shù)占總花粉粒數(shù)的百分率，花粉活力均用百分?jǐn)?shù)表示，進而求算每個重復(fù)的平均值。用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；對百分?jǐn)?shù)類型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為反正弦數(shù)據(jù)再進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉離體培養(yǎng)法最優(yōu)培養(yǎng)基篩選

2.1.1 3個因素對花粉萌發(fā)率的影響

采用L9(34)正交試驗通過花粉離體萌發(fā)測定花粉萌發(fā)率，由表2可知，蔗糖不同濃度對花粉離體萌發(fā)率影響較少，最佳的濃度為150 g/L的蔗糖；而硼酸和硝酸鈣對花粉萌發(fā)率的影響顯著(p<0.05)，硼酸的最優(yōu)濃度為第二水平(150 mg/L)，其次是第一水平(100 mg/L)，但兩者差異不顯著，而硝酸鈣的第一水平和第二水平濃度的差異也不明顯，對花粉萌發(fā)率影響最好的是第一水平(100 mg/L)。因此，就花粉萌發(fā)率而言，3個因素的最優(yōu)組合是A2B2C1。

表2 3個因素的不同水平對花粉離體萌發(fā)率的影響

水平因素蔗糖(A)硼酸(B)硝酸鈣(C)180.5683.48A86.35A284.2186.11A83.62A380.775.88B75.5B

注：同列數(shù)值不同大、小寫字母分別表示差異極顯著(p<0.01)和差異顯著(p<0.05)。下同。

2.1.2 3個因素對花粉管生長長度的影響

蔗糖、硼酸、硝酸鈣3個因素不同水平對花粉管生長長度的影響較大，蔗糖的不同濃度間對花粉管生長長度影響顯著(p<0.05)，最優(yōu)水平是A2，其次是A1，兩者差異不顯著；而硼酸和硝酸鈣不同濃度的影響達到了極顯著水平(p<0.01)(見表3)，硝酸鈣的C1、C2水平與C3水平差異極顯著，最優(yōu)水平是C1，硼酸的B1、B2、B33個水平兩兩之間差異都達到了極顯著水平，其中最佳的是B1，說明硼酸對花粉管長度影響起主要作用。如表3所示，最優(yōu)組合是A2B1C1。

表3 3個因素的不同水平對花粉管生長長度的影響

水平因素蔗糖(A)硼酸(B)硝酸鈣(C)1249.21ab375.62A278.04A2267.79a225.78B258.55A3216.93b132.53C197.35B

2.1.3 3個因素對花粉管長度的影響

由表4可知，蔗糖、硝酸鈣對最長花粉管長度的影響為顯著差異，而硼酸的影響為極顯著差異，但3個因素的最優(yōu)水平都是水平1，則最優(yōu)組合是A1B1C1。A1與A2、C1與C2之間差異不顯著，但分別與A3、C3達到極顯著差異，而硼酸的3個水平間彼此差異極顯著。

表4 3種因素的不同水平對最長花粉管長度的影響

水平因素蔗糖(A)硼酸(B)硝酸鈣(C)1547.8a765.44A563.6a 2533.19a450.82B507.24a 3414.87b279.59C425.01b

2.1.4 優(yōu)化水平組合的確定

綜合3個測定指標(biāo)的分析結(jié)果，且花粉萌發(fā)率是花粉萌發(fā)效果的主要指標(biāo)。蔗糖、硼酸、硝酸鈣3個因素中，硼酸對花粉萌發(fā)率、花粉管生長長度、最長花粉管長度的影響結(jié)果均達到了極顯著水平；而硝酸鈣對花粉萌發(fā)率、花粉管生長長度的影響達到極顯著水平，對最長花粉管長度的影響達到顯著水平；而蔗糖對花粉萌發(fā)率影響不顯著，對花粉管長度和最長花粉管長度差異影響顯著。因此，3個因素對茶樹花粉體外萌發(fā)效果的影響排序為B(硼酸)>C(硝酸鈣)>A(蔗糖)，最優(yōu)水平組合為A2B2C1，即150 g/L蔗糖+150 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸鈣，其次是100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸鈣，3種方法比較時用100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸鈣。

2.2 TTC法對花粉活力檢測

在TTC染色法試驗中，隨著TTC的濃度增加，被染為紅色和淡紅色的花粉粒增加，其中10 g/L TTC的著色花粉粒最多，達83.17%(1 h時)。除了2.5 g/L TTC和5 g/L TTC隨著培養(yǎng)時間增加而著色花粉粒增加，2.5 g/L TTC在0.5 h的著色花粉粒與1，1.5，2 h的著色花粉粒有顯著差異，而5 g/L TTC和10 g/L TTC在4個時間段的著色花粉數(shù)差異不顯著，且10 g/L TTC染色受時間的影響較小，1 h的著色花粉粒最多為83.17%，1.5 h和2 h的著色花粉數(shù)卻較1 h的少。TTC這種現(xiàn)象可能說明在2.5 g/L TTC和5 g/LTTC時，TTC底物不能滿足氧化還原反應(yīng)，隨著時間的增加，更多的TTC被還原為TTF，則著色花粉粒增多；而在10 g/L TTC時，TTC底物充足，在短暫的時間內(nèi)，過量的TTC即可通過花粉的呼吸作用的氫還原為TTF，因此，4個時間段著色花粉數(shù)差異不顯著，且與花粉離體萌發(fā)法結(jié)果相近，說明用10 g/L TTC染色法快速檢測花粉活力效果最佳，且該濃度染色時間以1 h即可(圖1)。

注：不同大寫字母表示同一時間不同濃度間差異極顯著(p<0.01)，不同小寫字母表示同一濃度不同時間差異顯著(p<0.05)。圖1 不同TTC濃度對茶樹花粉活力的影響

注：a為花粉離體培養(yǎng)液1培養(yǎng)生長情況，放大100倍；b為10 g/L TTC法30 min染色情況，放大100倍。圖2 不同方法的茶樹花粉活力測定比較

2.3 花粉活力檢測方法比較

如圖2所示，利用顯微鏡觀察，10 g/L TTC法對茶樹花粉的染色效果明顯，視野內(nèi)可清晰區(qū)分出花粉的紅色、淡紅色以及未著色花粉；花粉離體萌發(fā)法培養(yǎng)花粉，在顯微鏡下可明顯區(qū)分出萌發(fā)花粉粒，是一種直觀可靠的方法。

如表5所示，離體萌發(fā)法(100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸鈣)的測定結(jié)果最高，為90.04%， TTC法染色為83.17%。2種方法測定的花粉活力差異不顯著(p>0.05)，因離體萌發(fā)法和TTC法統(tǒng)計時易分辨，且重復(fù)性好，則可用這2種方法測定茶樹花粉活力(表5)，且TTC法可用于快速檢測茶樹花粉活力。

表5 2種方法測定茶樹花粉活力比較

方法花粉活力(%)花粉離體萌發(fā)90.04aTTC法83.17a

3 討 論

花粉離體萌發(fā)和花粉管的生長，需要適當(dāng)?shù)呐鹚岷外}離子。有研究認(rèn)為，硼酸可以促進花粉對蔗糖的吸收和代謝，從而促進花粉萌發(fā)。適宜的外源硼酸濃度可促進花粉萌發(fā)和花粉管生長[10-11]。鈣離子的動態(tài)變化對花粉萌發(fā)啟動、花粉管的生長調(diào)節(jié)具有重要作用[12]，花粉是否正常萌發(fā)和花粉管是否正常伸長，直接影響植物的受精作用。外源鈣離子可促進花粉管伸長，即花粉管在花柱中快速生長，縮短授粉時間。Wang 等認(rèn)為，外源鈣離子可以代替花粉萌發(fā)時的群體效應(yīng)，因此，花粉離體萌發(fā)時，適宜濃度的鈣離子能促進花粉萌發(fā)[13]。本研究結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的硼酸和鈣離子對于茶樹的離體萌發(fā)和花粉管生長均具有明顯的促進作用。蔗糖在花粉離體培養(yǎng)時，常作為基本培養(yǎng)基，除了為花粉萌發(fā)提供營養(yǎng)，還可以調(diào)節(jié)花粉的滲透壓。本研究發(fā)現(xiàn)，適合茶樹最優(yōu)的花粉離體培養(yǎng)的最優(yōu)蔗糖濃度為150 g/L，與西南樺(Betulaalnoides)[14]、核桃[15-16]、曼地亞紅豆杉(Taxusmedia‘Hicksii’)[8]、肉果秤錘樹[17]所需的蔗糖濃度一致。說明150 g/L蔗糖濃度對于多數(shù)不同種類植物的花粉離體萌發(fā)比較適合。許林等研究表明，福鼎大白茶和臺茶12號花粉離體萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為：10%(100 g/L)蔗糖+100 mg/L硼酸，花粉萌發(fā)率分別為54.09%和64.02%[7]；而本研究用培養(yǎng)基為100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸鈣，其花粉萌發(fā)率為90.04%，這種差異可能是在培養(yǎng)基中添加了硝酸鈣，促進了花粉的萌發(fā)。

花粉活力的快速測定，是保證后續(xù)育種工作順利進行的前提。用染色法測定花粉活力，具有簡便、快速的優(yōu)點，通常被用于快速檢測花粉活力[18]。TTC染色法原理是花粉萌發(fā)過程中由脫氫酶引起的氧化還原反應(yīng)，將無色的TTC發(fā)生還原反應(yīng)，生成紅色的三苯甲腙則有活力花粉被染成紅色，無活力花粉不顯色。5 g/L TTC可用于檢測曼地亞紅豆杉[8]和大豆[19]的花粉活力，而本研究結(jié)果以10 g/L TTC濃度的染色效果最好，這可能是因為不同物種花粉的差異導(dǎo)致。

有學(xué)者研究表明，福鼎大白茶的花粉萌發(fā)率可達到90%以上[2]。本研究的花粉活力測定方法結(jié)果與其相近，說明本試驗的花粉活力測定結(jié)果可靠。采用2種檢測方法的結(jié)果差異不顯著，則花粉離體萌發(fā)法和TTC法都可以用于檢測茶樹花粉活力，TTC法具有快速、易分辨、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，且與花粉離體萌發(fā)結(jié)果相近，因此，10 g/L TTC可用于快速檢測茶樹花粉活力。

4 結(jié) 論

硼酸和硝酸鈣對于茶樹花粉離體萌發(fā)和花粉管的伸長和生長有顯著的促進作用，最適的茶樹離體萌發(fā)培養(yǎng)基是150 g/L蔗糖+150 mg/L硼酸+100 mg/L。本研究通過比較花粉離體萌發(fā)法與TTC染色法檢測茶樹花粉活力，結(jié)果表明，適合茶樹花粉活力測定的方法為花粉離體萌發(fā)法和TTC染色法，但TTC法具有快速、易分辨、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，可用于茶樹花粉活力的快速測定，其最佳TTC濃度為10 g/L。