江榮花，杜建萍，崔 旸，張春艷，劉陽泰，朱江輝，王 翔，劉 箐，董慶利,*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險評估中心，北京 100053；3.國家食品安全風(fēng)險評估中心，北京 100022）

食源性致病菌的交叉污染是指制作表面污染致病菌的食品時操作不當(dāng)污染到其他食品。按照傳統(tǒng)的烹飪習(xí)慣，正常的加工條件（加熱一定時間）可保證食品商業(yè)無菌[1]，但部分食品在加工、運輸和銷售過程中，易被食源性致病菌污染[2]。

近年來，食源性致病菌污染引起的食品安全事故頻發(fā)，其中采用風(fēng)險評估手段評估食品風(fēng)險是世界公認的方法之一[3]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）2014年調(diào)查表明，2013—2014年期間，交叉污染是導(dǎo)致食源性疾病暴發(fā)的首要原因[4]。2013—2015年期間，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會對我國食物中毒事件的監(jiān)測結(jié)果表明，交叉污染是導(dǎo)致微生物性食物中毒人數(shù)最多的主要原因之一[5]。因此，為降低食源性疾病的暴發(fā)水平，整合交叉污染的風(fēng)險評估工作迫在眉睫。

低溫乳化香腸是以畜禽肉為主要原料，加入適當(dāng)輔料經(jīng)斬拌、灌裝、蒸煮和巴氏殺菌等加工工藝，中心溫度達到75～85 ℃并保持一定時間而制成的產(chǎn)品。其中，斬拌和灌裝過程的交叉污染現(xiàn)象尤為嚴重[6]。同時，低溫乳化香腸中污染主要來源于原料肉和食品介質(zhì)表面的間接接觸所造成的單增李斯特菌交叉污染[2]。

單增李斯特菌是人畜共患的食源性致病菌之一，可引起腦組織和血液感染。單增李斯特菌廣泛存在于環(huán)境中，如養(yǎng)殖場周圍的水源和土壤中，通過食物鏈導(dǎo)致畜禽感染，從而導(dǎo)致原料肉污染[7]。另外，在低溫乳化香腸的加工、運輸和貯藏過程中也可造成單增李斯特菌的污染[8]。根據(jù)WHO 2006年調(diào)查表明，單增李斯特菌污染低溫乳化香腸的概率高達10%以上[9]，較易引起相關(guān)的食源性疾病。因此，對低溫乳化香腸進行單增李斯特菌的定量風(fēng)險評估刻不容緩。

風(fēng)險評估的核心內(nèi)容是暴露評估，微生物定量暴露評估是對通過食物攝入或其他相關(guān)途徑暴露于人體或環(huán)境中的食源性致病菌的定量評估[10]。基于定量暴露評估的結(jié)果，結(jié)合劑量效應(yīng)模型（dose-response，DRM）可對人群發(fā)病率進行描述。目前已有部分香腸中食源性致病菌的風(fēng)險評估研究，Gonzales-Barron等[11]對鮮肉香腸中鼠傷寒沙門氏菌進行定量風(fēng)險評估研究，結(jié)果表明，低溫貯藏過程中，10萬 包香腸中約有83 包中沙門氏菌濃度高于103CFU/g，存在食用風(fēng)險。相似的研究見于Syne[12]及Al-Nabulsi[13]等的研究中。因缺乏監(jiān)測和單增李斯特菌的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，目前香腸中單增李斯特菌的風(fēng)險評估研究多為定性或半定量的風(fēng)險評估。國家食品安全風(fēng)險評估中心曾于2014—2015年開展了即食食品（包括香腸）中單增李斯特菌初步的定量風(fēng)險評估（結(jié)果未公開）[14]。有研究表明，香腸加工過程中，絞肉和斬拌后，單增李斯特菌的檢出率分別為24.2%及20.8%[15]。以上研究僅包括了部分加工過程，且未涉及加工過程的單增李斯特菌交叉污染，因此，整合交叉污染的香腸加工過程中單增李斯特菌的定量風(fēng)險評估急待明確。

本實驗?zāi)M香腸斬拌和灌裝過程中的常見場景，測定單增李斯特菌在肉樣、斬拌機和灌腸機之間的轉(zhuǎn)移率，進而基于斬拌和灌裝過程的交叉污染結(jié)果構(gòu)建香腸加工過程中單增李斯特菌的暴露評估模型，并從方法論的角度，應(yīng)用指數(shù)模型、Beta-Poisson模型、Weibull-Gamma模型和Log-Logistic模型等常見劑量效應(yīng)模型擬合和比較健康人群和易感人群食用污染香腸后的發(fā)病率大小，選擇最優(yōu)的劑量效應(yīng)模型，為香腸加工過程單增李斯特菌完整的風(fēng)險評估研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

瘦肉選用去骨去皮的精腿肉，肥肉選用豬脊膘，輔料選用食鹽、亞硝酸鈉、復(fù)合磷酸鹽、大豆分離蛋白和淀粉，具體配方[16]見表1。以上材料均購于上海卜蜂蓮花超市。

表1 低溫乳化香腸的基本配方Table1 Formulation of low-temperature emulsified sausages

胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯（trypticase soy-yeast extract broth，TSB-YE）培養(yǎng)基、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（trypticase soy-yeast extract agar，TSA-YE）培養(yǎng)基、單增李斯特菌選擇性培養(yǎng)基（Palcam瓊脂培養(yǎng)基）青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HLQ-8型斬拌機 安徽華菱西廚裝備股份有限公司；MLG-7型灌腸機 山東麥苗廚具有限公司；YP405N型電子天平 上海精密儀器儀表有限公司；YXQ-LS-75SII型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司；BCM-239D型無菌操作臺 江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Scientz-09型無菌均質(zhì)器 浙江寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株選用和菌懸液制備

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes ATCC 13932血清型4b）保存于（4.0±0.5）℃的TSA-YE培養(yǎng)基上備用。用無菌接種環(huán)從TSA-YE培養(yǎng)基上挑取一環(huán)菌苔，接種于100 mL的TSB-YE培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)（16±1）h至菌體濃度達到穩(wěn)定期（109CFU/mL），制得初始菌懸液。用無菌生理鹽水（質(zhì)量分數(shù)0.85% NaCl溶液）稀釋初始菌懸液，得到108CFU/mL的菌懸液。

1.3.2 介質(zhì)接種與場景設(shè)計

模擬香腸加工過程，分別將250 g瘦肉和100 g肥肉切至約25 g/塊肉樣，肉樣置于80 ℃熱水中滅菌20 s。于無菌操作臺內(nèi)將肉樣用無菌鑷子夾入無菌均質(zhì)袋中，并加入食鹽，置于（4.0±0.5）℃冰箱中腌制24 h。

腌制后肉樣置于潔凈器皿表面，移液槍分別移取1 mL上述菌懸液（108CFU/mL）于每塊肉樣表面，無菌鉗翻動肉樣數(shù)次，靜置15 min。將靜置后的肉樣置于斬拌機內(nèi)，并加入輔料斬拌6 min。

斬拌后肉糜置于灌腸機內(nèi)進行灌裝，制得半成品，每組實驗重復(fù)5 次。肉糜和半成品的帶菌量根據(jù)GB 4789.2—2010《食品安全國家標(biāo)準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[17]進行定量測定，使用擦拭取樣法測定斬拌機的斬刀和斬鍋表面以及灌腸機的料桶和料斗表面的單增李斯特菌。

1.3.3 轉(zhuǎn)移率測定

轉(zhuǎn)移率（transfer rate，TR）是一個細菌從供體表面通過相互接觸轉(zhuǎn)移到受體表面的概率[18]，計算公式如下。

式中：Nd為細菌供體表面帶菌量（lg（CFU/g））；Nr為細菌受體表面帶菌量（lg（CFU/g））。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應(yīng)用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，基于蒙特卡洛模擬和卡方分析，用@Risk5.5軟件擬合轉(zhuǎn)移率和肉樣中單增李斯特菌菌量的最優(yōu)分布。

1.5 低溫乳化香腸加工過程中的暴露評估模型

圖1 低溫乳化香腸加工過程的暴露評估模型Fig.1 Exposure assessment model for low-temperature emulsified sausage processing

表2 低溫乳化香腸加工過程的暴露評估模型參數(shù)設(shè)置Table2 Parameter settings of exposure assessment model for chilledemulsified sausage processing

續(xù)表2

單增李斯特菌從原料肉至香腸成品整個加工階段的暴露評估模型如圖1所示。暴露評估模型參數(shù)設(shè)置見表2，污染數(shù)據(jù)的陽性率一般符合Beta（α1，α2）分布，形狀參數(shù)α1和α2對應(yīng)的公式一般為：α1＝S+1，α2＝n-S+1，其中n是取樣數(shù)，S是陽性檢出數(shù)。應(yīng)用@Risk5.5軟件分別得到Pp和Pn，進而用離散型分布Discrete（1，0，Pp，Pn）描述Pc。Discrete（1，0，Pp，Pn）中，假定參數(shù)1是生鮮肉中污染單增李斯特菌的情況，對應(yīng)Pp；參數(shù)0是生鮮肉中未污染單增李斯特菌的情況，對應(yīng)Pn。

應(yīng)用@Risk5.5軟件分別對斬拌和灌裝過程中實驗數(shù)據(jù)進行處理，擬合出轉(zhuǎn)移率和各介質(zhì)表面單增李斯特菌濃度的最優(yōu)分布。

烘烤過程中，參照文獻[21-23]，應(yīng)用@Risk5.5軟件得出烘烤溫度和烘烤時間的分布。香腸中單增李斯特菌的一級失活模型采用線性模型，進而用Origin 9.0軟件擬合出烘烤過程的二級失活模型。貯藏過程中，參照ComBase數(shù)據(jù)庫和文獻[25]，用@Risk5.5軟件得出貯藏溫度和貯藏時間的分布。香腸中單增李斯特菌的一級生長模型采用Baranyi模型?？紤]貯藏溫度對香腸中單增李斯特菌生長的影響，采用Gamma分布進行描述。

消費過程中，發(fā)病風(fēng)險區(qū)分2 類人群，分別為健康人群和易感人群，健康人群包括成年人，易感人群包括嬰幼兒、老年人和孕婦?；诿商乜宄闃臃椒?，發(fā)病風(fēng)險采用指數(shù)、Beta-Poisson、Weibull-Gamma和Log-Logistic 4 種劑量效應(yīng)模型[34]對健康人群和易感人群的發(fā)病率進行描述，進而用@Risk5.5軟件對發(fā)病率進行最佳分布擬合，并根據(jù)卡方檢驗結(jié)果選擇最適分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 斬拌和灌裝過程中單增李斯特菌的轉(zhuǎn)移率

圖2 斬拌和灌裝過程中單增李斯特菌在不同介質(zhì)表面間的轉(zhuǎn)移率Fig.2 Transfer rates of L. monocytogenes between different contact surfaces during chopping and stuffing

如圖2所示，斬拌場景中，TRmc和TRce有顯著性差異（P＜0.05），同時，TRmp和TRpe有顯著性差異（P＜0.05）。灌裝場景中，TReb和TRbs有顯著性差異（P＜0.05），同時，TReh和TRhs有顯著性差異（P＜0.05）。綜上，斬拌和灌裝兩種場景下，單增李斯特菌由設(shè)備至肉樣的轉(zhuǎn)移量顯著低于由肉樣至設(shè)備的轉(zhuǎn)移量（數(shù)據(jù)未列出），肉樣至設(shè)備的轉(zhuǎn)移率和設(shè)備至肉樣的轉(zhuǎn)移率均有顯著性差異，單增李斯特菌由設(shè)備至肉樣的轉(zhuǎn)移率顯著高于由肉樣至設(shè)備的轉(zhuǎn)移率。

2.2 健康人群和易感人群食用污染香腸的發(fā)病率

圖3 健康人群食用污染香腸的發(fā)病率Fig.3 Morbidity of healthy populations after consumption of contaminated sausages

根據(jù)香腸加工過程中暴露評估模型參數(shù)設(shè)置（表2），應(yīng)用不同劑量效應(yīng)模型擬合消費者食用污染香腸的發(fā)病率，采用@Risk5.5軟件分別進行10 000 次蒙特卡洛模擬，結(jié)果如圖3、4所示。圖3展現(xiàn)了健康人群因食用污染單增李斯特菌的香腸而導(dǎo)致發(fā)病的概率。健康人群對病原微生物的入侵具有一定抵抗力，因此相對于易感人群，低劑量下（0～3（lg（CFU/g））健康人群的發(fā)病率較低。由圖3可知，以Weibull-Gamma模型為例，當(dāng)不考慮斬拌和灌裝過程的交叉污染情況時，健康人群的攝入劑量為1.37（lg（CFU/g）），對應(yīng)的發(fā)病率為3%；但考慮斬拌和灌裝過程的交叉污染時，健康人群的攝入劑量為7.46（lg（CFU/g）），對應(yīng)的發(fā)病率為36%，說明考慮交叉污染對健康人群食用污染香腸的風(fēng)險描述有顯著影響。以健康人群每餐攝入劑量為6（lg（CFU/g））時為例，Weibull-Gamma模型預(yù)測的發(fā)病率（30%）顯著高于指數(shù)模型（0）、Beta-Poisson模型（10%）和Log-Logistic模型（0）的預(yù)測結(jié)果?；陲L(fēng)險評估研究一般從高估風(fēng)險的角度，對比其他3 類模型，采用Weibull-Gamma模型預(yù)測健康人群食用污染香腸的發(fā)病率結(jié)果最大，風(fēng)險最高，擬合效果最好，因此建議選擇Weibull-Gamma模型進行健康人群發(fā)病率預(yù)測。

圖4 易感人群食用污染香腸的發(fā)病率Fig.4 Morbidity of susceptible populations after consumption of contaminated sausages

圖4 反映了易感人群因食用污染單增李斯特菌的香腸而導(dǎo)致發(fā)病的概率。對比圖3中健康人群發(fā)病率結(jié)果，4 類模型預(yù)測易感人群發(fā)病率結(jié)果均有顯著提高。由圖4可知，以Weibull-Gamma模型為例，當(dāng)不考慮斬拌和灌裝過程的交叉污染情況時，易感人群的攝入劑量為1.20（lg（CFU/g）），對應(yīng)的發(fā)病率為3%；但考慮斬拌和灌裝過程的交叉污染時，易感人群的攝入劑量為7.30（lg（CFU/g）），對應(yīng)的發(fā)病率為39%，說明考慮交叉污染對易感人群食用污染香腸的風(fēng)險描述有顯著影響。以易感人群每餐攝入劑量為6（lg（CFU/g））時為例，對比其他3 類模型，Weibull-Gamma模型預(yù)測發(fā)病率的結(jié)果（35%）顯著高于指數(shù)模型（0）、Beta-Poisson模型（14%）和Log-Logistic模型（4%）的預(yù)測結(jié)果，因此建議選擇Weibull-Gamma模型進行易感人群發(fā)病率預(yù)測。

2.3 發(fā)病率的概率分布擬合

應(yīng)用Weibull-Gamma模型預(yù)測健康人群和易感人群食用污染香腸后發(fā)病率的概率分布擬合如圖5、6所示，經(jīng)最佳分布擬合，Logistic（0.42，0.08）和Logistic（0.46，0.08）可分別對健康人群和易感人群的發(fā)病率進行較好描述。健康人群食用污染香腸后的發(fā)病率從8%（5%置信水平）至59%（95%置信水平），易感人群食用污染香腸后的發(fā)病率從10%（5%置信水平）至62%（95%置信水平）。

圖5 健康人群食用污染香腸發(fā)病率的概率分布擬合Fig.5 Probability distribution fitting of morbidity of healthy populations after consumption of contaminated sausages

圖6 易感人群食用污染香腸發(fā)病率的概率分布擬合Fig.6 Probability distribution fitting of morbidity of susceptible populations after consumption of contaminated sausages

3 討 論

3.1 不同轉(zhuǎn)移方向下單增李斯特菌轉(zhuǎn)移率差異的分析

影響致病菌轉(zhuǎn)移的因素可劃分為兩類：環(huán)境因素和內(nèi)在因素。環(huán)境因素主要涉及材料表面的物理特征，包括濕度、壓力、粗糙度和接觸時間等；內(nèi)在因素主要涉及菌種，包括胞外多糖的生產(chǎn)能力、菌膜形成能力和有無細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)等[36-38]。

介質(zhì)表面粗糙度和濕度是影響本實驗轉(zhuǎn)移率結(jié)果的主要原因。本研究表明，單增李斯特菌由設(shè)備至肉樣的轉(zhuǎn)移率顯著高于由肉樣至設(shè)備的轉(zhuǎn)移率，光滑的設(shè)備表面更易促進單增李斯特菌的轉(zhuǎn)移。Ravishankar等[39]研究切割生菜過程中沙門氏菌的轉(zhuǎn)移情況，結(jié)果表明，對比沙門氏菌從生菜至無菌刀片的轉(zhuǎn)移情況，沙門氏菌從刀片至無菌生菜的轉(zhuǎn)移率更高。因此，介質(zhì)表面粗糙度會影響致病菌的轉(zhuǎn)移，相似的研究見于Lundén[40]和Midelet[41]等的研究中。另外，表面濕度亦會影響致病菌的轉(zhuǎn)移[42]，微生物易吸附于潮濕的介質(zhì)表面，因此含有較高水分的肉樣更適應(yīng)于單增李斯特菌的吸附，從而限制單增李斯特菌向設(shè)備的轉(zhuǎn)移能力。綜上，介質(zhì)表面的粗糙度和濕度會影響致病菌的轉(zhuǎn)移能力。

3.2 整合交叉污染的風(fēng)險評估研究對人群發(fā)病率的影響

風(fēng)險評估由4 部分內(nèi)容組成：危害識別、危害特征描述、暴露評估和風(fēng)險特征描述[43]。本實驗側(cè)重描述低溫乳化香腸加工過程的暴露評估和風(fēng)險特征描述。本研究表明，對比未考慮交叉污染的人群發(fā)病率結(jié)果，整合交叉污染的人群發(fā)病率結(jié)果明顯提高。日常加工操作中，設(shè)備清洗不當(dāng)或操作人員衛(wèi)生不合格均會造成致病菌的交叉污染。已有大量研究表明香腸加工過程中，斬拌、灌裝和包裝等過程均有致病菌交叉污染現(xiàn)象，且斬拌和灌裝過程的交叉污染尤為嚴重[6]。有研究顯示香腸加工過程中，沙門氏菌在不同介質(zhì)間轉(zhuǎn)移率顯著，但這些研究主要側(cè)重于香腸加工過程中某一環(huán)節(jié)沙門氏菌的交叉污染情況[44-46]。而單增李斯特菌廣泛存在于香腸加工環(huán)境中，且可在香腸貯藏環(huán)境中生長。關(guān)于香腸加工過程中單增李斯特菌交叉污染的研究可為香腸加工過程中完整的風(fēng)險評估研究提供借鑒。

3.3 劑量效應(yīng)模型的比較和選擇

劑量效應(yīng)模型主要包括單參數(shù)模型、雙參數(shù)模型和三參數(shù)模型。指數(shù)模型是單參數(shù)劑量效應(yīng)模型，擬合過程較易但一般不能充分擬合劑量效應(yīng)數(shù)據(jù)；Beta-Poisson模型是迄今已刊研究中模擬劑量效應(yīng)關(guān)系最久的雙參數(shù)劑量效應(yīng)模型[47]，已廣泛應(yīng)用于微生物定量風(fēng)險評估研究中，但Marks等[48]質(zhì)疑了Beta-Poisson模型的充分性；Log-Logistic模型是雙參數(shù)劑量效應(yīng)模型，對低劑量下的效應(yīng)關(guān)系具有良好的擬合性[49]；據(jù)有限文獻調(diào)研表明，Weibull-Gamma模型是文獻中記載最多的三參數(shù)劑量效應(yīng)模型[50]，當(dāng)三參數(shù)中某參數(shù)為1時，Weibull-Gamma模型可以轉(zhuǎn)化為Beta-Poisson模型或Log-Logistic模型，對比雙參數(shù)劑量效應(yīng)模型，三參數(shù)劑量效應(yīng)模型的擬合效果更優(yōu)，但擬合過程一般很難獲得三參數(shù)劑量效應(yīng)模型所需不少于4 個劑量水平的數(shù)據(jù)。

本研究中對比指數(shù)模型、Beta-Poisson模型和Log-Logistic模型的擬合結(jié)果，Weibull-Gamma模型預(yù)測消費者食用污染香腸的發(fā)病率結(jié)果最大，風(fēng)險最高，擬合效果最好，基于風(fēng)險評估研究一般從高估風(fēng)險的角度，因此建議選用Weibull-Gamma模型作為低溫乳化香腸中單增李斯特菌的最優(yōu)劑量效應(yīng)模型。Moon等[51]基于志愿者暴露于致病菌下感染和患病的數(shù)據(jù)，對比和評估了4 種雙參數(shù)劑量效應(yīng)模型和4 種三參數(shù)劑量效應(yīng)模型的擬合效果，結(jié)果表明，Weibull-Gamma模型對觀測數(shù)據(jù)的擬合效果最優(yōu)。董慶利等[52]基于2001—2011年我國米飯中蠟樣芽孢桿菌導(dǎo)致食物中毒的數(shù)據(jù)，構(gòu)建了米飯中蠟樣芽孢桿菌的劑量效應(yīng)模型，數(shù)學(xué)檢驗結(jié)果表明，Weibull-Gamma模型的擬合效果明顯優(yōu)于其他模型。關(guān)于香腸中單增李斯特菌劑量效應(yīng)模型的選用可為控制香腸加工過程中單增李斯特菌的交叉污染提供借鑒。

4 結(jié) 論

本實驗研究了低溫乳化香腸加工過程中斬拌和灌裝過程單增李斯特菌的交叉污染情況。結(jié)果表明：單增李斯特菌由設(shè)備至肉樣的轉(zhuǎn)移率顯著高于由肉樣至設(shè)備的轉(zhuǎn)移率。構(gòu)建了低溫乳化香腸加工過程中的暴露評估模型，比較了4 種劑量效應(yīng)模型下健康人群和易感人群的發(fā)病率，建議選擇Weibull-Gamma模型進行消費者食用污染香腸的發(fā)病率預(yù)測。同時研究了交叉污染對低溫乳化香腸加工過程中風(fēng)險評估的影響，結(jié)果表明：整合交叉污染的風(fēng)險評估研究結(jié)果中消費者的發(fā)病率顯著提高。