李 瀟，徐 繁，房 亮，曹向宇，姜海軍，肖 旭

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000）

秦皮乙素降低多柔比星誘導(dǎo)心臟毒性的研究*

李 瀟，徐 繁△，房 亮，曹向宇，姜海軍，肖 旭

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000）

目的:探討秦皮乙素（Esc）對多柔比星（DOX）誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法：培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞并分為對照組、模型（DOX）組和干預(yù)（Esc+DOX）組。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平；蛋白印跡法檢測cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：模型組H9C2細(xì)胞凋亡數(shù)量、ROS水平，cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid蛋白表達(dá)明顯高于對照組，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯低于對照組（P＜0.05）；干預(yù)組H9C2細(xì)胞凋亡數(shù)量、ROS水平，cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid蛋白表達(dá)明顯低于模型組，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于模型組（P＜0.05）。結(jié)論：秦皮乙素可減輕多柔比星所致的心臟毒性，其作用機(jī)制與減少細(xì)胞凋亡、降低ROS水平有關(guān)。

多柔比星；秦皮乙素；心臟毒性

多柔比星（DOX）是一種具有強(qiáng)抗腫瘤作用的蒽環(huán)類抗生素，主要用于治療乳腺癌、淋巴瘤和黑色素瘤等，但可造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如不可逆轉(zhuǎn)的心肌病和充血性心力衰竭。因此，多柔比星的臨床應(yīng)用非常有限[1]。多柔比星誘導(dǎo)心臟毒性的機(jī)制比較復(fù)雜，包括刺激自由基形成增加、線粒體損傷、細(xì)胞凋亡等[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，多柔比星可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、增加活性氧（ROS）的生成，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[3]。秦皮乙素（Esc）是中藥秦皮的主要活性成分，具有止咳、祛痰、平喘的功效，以及抗炎、保肝、抗腫瘤等作用[4]。有研究表明，秦皮乙素可清除氧自由基、保護(hù)細(xì)胞免受過氧化物造成的損傷[5-6]。因此推測，秦皮乙素是否具有保護(hù)多柔比星所致心肌細(xì)胞損傷的作用？為此，本研究建立了多柔比星致大鼠胚胎心肌細(xì)胞（H9C2細(xì)胞）損傷模型，以探討秦皮乙素保護(hù)多柔比星致心肌細(xì)胞損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9C2，來源于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS），購于HyClone Laboratories公司（美國）；Lipofectamine RNAiMAX BCA蛋白濃度測定試劑盒、AV-PI檢測試劑盒，購于Beyotime生物技術(shù)公司（中國南通）；Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、Bid、Bcl-2、GAPDH一抗（兔來源多抗）、二抗（羊抗兔IgG HRP抗體），購于Proteintech公司(中國武漢)；DCFH-DA，購于Invitrogen公司（美國）；多柔比星、秦皮乙素，購于阿拉丁生物化學(xué)技術(shù)有限公司（中國上海）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) H9C2細(xì)胞用含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶底部的80%時(shí)，使用胰蛋白酶消化以制備單細(xì)胞懸液。然后根據(jù)需要將細(xì)胞接種到培養(yǎng)板中進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測H9C2細(xì)胞的活力 將H9C2細(xì)胞接種到96孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml，細(xì)胞分為三組，對照組、5μM秦皮乙素組和10μM秦皮乙素組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。對照組細(xì)胞只加培養(yǎng)基，兩個(gè)秦皮乙素組細(xì)胞分別加入5μM、10μM秦皮乙素培養(yǎng)2小時(shí)；然后各組細(xì)胞加入不同濃度的多柔比星（0μM、1μM、2μM、4μM、8μM、16μM）繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。丟棄培養(yǎng)液并用PBS洗滌三次，然后每孔加入濃度為5mg/ml的MTT工作溶液；4小時(shí)后，加入100μl二甲基亞楓（DMSO），振蕩10分鐘。用酶標(biāo)儀在570nm處檢測吸光值（OD），并計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=（給藥組OD/空白組OD）×100%。

1.4 AV-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測H9C2細(xì)胞凋亡 將H9C2細(xì)胞接種到6孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。將細(xì)胞分成三組，對照組，模型組（DOX）和干預(yù)組（Esc+DOX），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。對照組細(xì)胞只加入培養(yǎng)基；模型組細(xì)胞加入8μM多柔比星培養(yǎng)48小時(shí)；干預(yù)組細(xì)胞先加入10μM秦皮乙素培養(yǎng)2h，然后加入8μM多柔比星繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞并用胰蛋白酶進(jìn)行消化。將收集的細(xì)胞重懸于0.3ml結(jié)合緩沖液中，加入5μl AV和5μl PI室溫下避光孵育15分鐘，然后加入0.2ml結(jié)合緩沖液，使用流式細(xì)胞儀檢測每組細(xì)胞的凋亡情況。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測H9C2細(xì)胞ROS水平 H9C2細(xì)胞分組和處置方法同1.4。培養(yǎng)結(jié)束后，在細(xì)胞中加入10μM DCFH-DA染色溶液，37℃避光孵育20分鐘，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞ROS的水平。

1.6 蛋白印跡法檢測H9C2細(xì)胞cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid和Bcl-2蛋白的表達(dá) H9C2細(xì)胞分組和處置方法同1.4。培養(yǎng)后收集細(xì)胞，RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕式轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，分別加入cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid、Bcl-2、GAPDH一抗（1：1000）4℃孵育過夜，二抗（1：2000稀釋）室溫下孵育2h，ECL超敏發(fā)光液顯影并攝片。以目的條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值作為各目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，三組計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H9C2細(xì)胞的存活率 MTT結(jié)果顯示，隨著多柔比星濃度的增加，對照組H9C2細(xì)胞存活率逐漸下降，呈濃度依賴性（P＜0.05）。與對照組細(xì)胞相比，5μM和10μM的秦皮乙素預(yù)處理H9C2細(xì)胞2小時(shí)，H9C2細(xì)胞的存活率明顯升高（P＜0.01）；并且，10μM秦皮乙素的效果優(yōu)于5μM秦皮乙素（P＜0.05）。附圖A。

2.2 H9C2細(xì)胞的凋亡情況和ROS的水平 模型組H9C2細(xì)胞凋亡數(shù)量、ROS水平明顯高于對照組，干預(yù)組H9C2細(xì)胞凋亡數(shù)量和ROS水平明顯低于模型組（P＜0.05）。見附圖B，附表：

附表 H9C2細(xì)胞ROS水平和相關(guān)蛋白的表達(dá)情況（±s ,n=3）

附表 H9C2細(xì)胞ROS水平和相關(guān)蛋白的表達(dá)情況（±s ,n=3）

與模型組比較：**P＜0.01

組別ROS水平cleaved Caspase-3cleaved PARPBidBcl-2對照組93.46±4.11**0.235±0.057**0.197±0.019**0.507±0.101**0.674±0.054**模型組189.71±7.631.492±0.1710.526±0.0610.232±0.1100.241±0.073干預(yù)組118.13±9.56**0.218±0.057**0.223±0.027**0.452±0.051**0.662±0.028**

2.3 H9C2細(xì)胞cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況 模型組H9C2細(xì)胞cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid蛋白表達(dá)明顯高于對照組，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯低于對照組（P＜0.05）；干預(yù)組H9C2細(xì)胞cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid蛋白表達(dá)明顯低于模型組，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于模型組（P＜0.05）。見附圖C-D，附表。

附圖 各指標(biāo)檢測結(jié)果

3 討論

多柔比星（DOX）是一種廣泛用于惡性腫瘤化療的蒽環(huán)類藥物，治療腫瘤效果顯著，但多柔比星具有明顯的心臟毒性，嚴(yán)重制約了其在臨床上的應(yīng)用，盡可能減輕化療時(shí)多柔比星的心臟毒性一直是臨床醫(yī)師關(guān)注的問題。

多柔比星誘導(dǎo)心臟毒性的機(jī)制比較復(fù)雜，包括細(xì)胞內(nèi)活性氧生成增加、線粒體功能紊亂、DNA損傷、細(xì)胞凋亡等[7]。本研究亦證實(shí)了上述研究結(jié)果，加入多柔比星的模型組H9C2細(xì)胞凋亡數(shù)量和ROS水平明顯高于對照組；同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，模型組H9C2細(xì)胞與凋亡相關(guān)的蛋白，cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid表達(dá)明顯升高，Bcl-2表達(dá)明顯降低。現(xiàn)已證明，細(xì)胞凋亡包括線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑等三條。Caspase-3是凋亡過程中最關(guān)鍵的蛋白酶，是多種死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分。Caspase-3活化后，可酶解、切割特異性底物，如DNA依賴性蛋白激酶、固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白等，通過改變其結(jié)構(gòu)或影響特定信號分子引起細(xì)胞凋亡[8]。cleaved PARP是凋亡細(xì)胞中活化的Caspase-3的水解產(chǎn)物，是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。Bid和Bcl-2是Bcl-2家族中具有代表性的成員，Bid蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡[9]。

本研究結(jié)果顯示，加入秦皮乙素的干預(yù)組H9C2細(xì)胞，凋亡數(shù)量明顯減少，ROS水平及cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高。本研究提示，秦皮乙素可通過調(diào)節(jié)cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid、Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)減少細(xì)胞凋亡，以及通過減少活性氧的產(chǎn)生，減輕多柔比星對心肌細(xì)胞的毒性。本研究可為相關(guān)臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但秦皮乙素減輕多柔比星致心臟毒性的其他機(jī)制尚需深入探討。

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STUDY ON ESCULETIN REDUCE CARDIOTOXICITY INDUCED BY DOXORUBICIN

LI Xiao, XU Fan, FANG Liang, et al

(the Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the protective effects and mechanisms of esculetin (Esc) on H9C2 cells injury induced by doxorubicin (DOX).Methods:The H9C2 cells were cultured and divided into control group, model(DOX) group and intervention (Esc+DOX) group. Flow cytometry was used to detect apoptosis of H9C2 cells and reactive oxygen (ROS) level in H9C2 cells; Western blotting to detect the cleaved Caspase-3, cleaved PARP, Bid and Bcl-2 protein expression in H9C2 cells.Results:The number of apoptosis, ROS level, cleaved Caspase-3, cleaved PARP and Bid protein expression in H9C2 cells in model group were obviously higher than control group; the Bcl-2 protein expression were obviously lower (P<0.05). The number of apoptosis, ROS level, cleaved Caspase-3, cleaved PARP and Bid protein expression in H9C2 cells in intervention group were obviously lower than model group; the Bcl-2 protein expression were obviously higher (P<0.05).Conclusions:Esculetin can reduce cardiotoxicity induced by doxorubicin by reducing apoptosis and ROS level.

Doxorubicin; Esculetin; Cardiotoxicity

R453.9

A

1004-6879（2018）01-0011-04

* 河北省2017年度醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃（20170886）

△ 通訊作者

2017-04-04）

(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)欄目編輯：陳志宏)