林麗清，汪欣，夏九學(xué)，姜甜，方曙光

（江蘇微康生物科技有限公司，蘇州 215000）

0 引 言

隨著生活水平的提高，人們對酸奶的認(rèn)知也越來越多，需求量也在日益增加，自然對酸乳的風(fēng)味也有較高的要求，而酸奶發(fā)酵劑作為酸奶制作過程中主要的微生物培養(yǎng)材料，在乳制品發(fā)酵過程中有著至關(guān)重要的作用，對發(fā)酵乳制品風(fēng)味和質(zhì)地的形成以及品質(zhì)具有重要的影響[1]。酸乳發(fā)酵主要是乳酸菌主導(dǎo)的過程，傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品較好的保留了乳酸菌的發(fā)酵特性與風(fēng)味，使發(fā)酵酸乳的香氣與風(fēng)味更為突出[2]，其中乳酸菌的產(chǎn)酸性能、持水性和蛋白水解能力對酸乳的狀態(tài)和風(fēng)味有很大的影響[3-4]。市售乳酸菌常被作為發(fā)酵劑用于食品工業(yè)中提升酸奶等發(fā)酵食品的質(zhì)地、風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值[5]。因此，對乳酸菌發(fā)酵劑發(fā)酵性能的篩選方法和發(fā)酵條件的研究成為很多學(xué)者的研究熱點(diǎn)。

我國是最早利用乳酸菌發(fā)酵食品的國家之一，有著豐富的傳統(tǒng)發(fā)酵食品資源，遼闊地域上各民族都有獨(dú)特的民族特色傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，在新疆、內(nèi)蒙、甘肅等地，長期的游牧生活孕育了很多優(yōu)質(zhì)的益生菌[6-7]。如酸馬奶、奶豆腐、奶酪、稀奶油、奶疙瘩等，這些乳制品中含有豐富的乳酸菌，自然選擇的結(jié)果是這些乳酸菌很好地保存了其生物學(xué)特性，同時(shí)制作方法有著明顯的地域性以及戶籍性，從而賦予了乳制品濃厚的地域特色和風(fēng)味，保存了其中有益微生物，尤其是傳接了賦予乳制品獨(dú)特風(fēng)味的乳酸菌的自然特性。奶豆腐,作為內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品之一,具有幾千年的食用歷史，本文以內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品奶豆腐為原料，通過分離、純化篩選出產(chǎn)酸、產(chǎn)香和產(chǎn)粘性能好的乳酸菌發(fā)酵菌種，同時(shí)從基因分子水平對菌株進(jìn)行鑒定，為開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)和性能優(yōu)越的直投式酸奶發(fā)酵劑提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料儀器

1.1.1 材料

內(nèi)蒙古錫林格勒盟正藍(lán)旗不同牧民家庭自制發(fā)酵奶豆腐樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MRS）：葡萄糖 20.0 g，蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 10.0 g，酵母膏 5.0 g，檸檬酸氫二銨 2.0 g，吐溫-80 1.0 mL，乙酸鈉 5.0 g，磷酸氫二鉀 2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL。

分離培養(yǎng)基：MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基加上2%質(zhì)量濃度的碳酸鈣，碳酸鈣用牛皮紙包裹，單獨(dú)滅菌，臨用時(shí)加入。

種子培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.1.3 試劑與儀器

市售純牛奶、白砂糖、三氯乙酸、OPA試劑、甲醇、硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉、β-巰基乙醇、亮氨酸、WFZ UV-2000紫外-可見分光光度計(jì)、DHG-9053A型電熱鼓風(fēng)干燥箱、SJH-4S型數(shù)控精密恒溫水浴鍋、DG250型厭氧培養(yǎng)箱、CT 14RD型臺式高速冷凍離心機(jī)、TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀、三氯乙酸、OPA試劑、甲醇、硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉、β-巰基乙醇、亮氨酸、分析天平等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離

將奶豆腐樣品搗碎后稀釋，選取10-2～10-54個(gè)稀釋梯度，吸取1 mL稀釋液，加入到滅菌的平板中，傾入20 mL冷卻到55℃左右的含2%碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)72 h[6]。挑選溶鈣圈較大的菌落進(jìn)行連續(xù)劃線至得到純化的單菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，將典型的鏈球狀菌株保藏。

1.2.2 乳酸菌的鑒定

對純化的菌落提取總DNA，以1492r、27F為引物擴(kuò)增16SrDNA，將PCR產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程有限公司測序。將測定的16S rDNA序列用BLAST軟件與GenBank中已知的16SrDNA序列同源性進(jìn)行比較，選取屬內(nèi)同源性較高的模式細(xì)菌的16 SrDNA序列進(jìn)行遺傳距離計(jì)算，并根據(jù)遺傳距離計(jì)算結(jié)果用NJ法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹[7]。

1.2.3 酸奶發(fā)酵測試

市售純牛奶中，按比例加入6%的白砂糖，95℃殺菌5 min，冷卻到43℃待用。將活化后的菌株按體積分?jǐn)?shù)1%的比例接種于殺菌處理的純牛奶中，43℃發(fā)酵，跟蹤酸度變化，當(dāng)酸度達(dá)到70°T，終止發(fā)酵，置于4℃冰箱中冷卻后熟。酸奶冷藏過夜后取出，待酸奶溫度恢復(fù)到10～15℃時(shí)，選取10名食品專業(yè)人員從色澤、滋氣味和組織狀態(tài)等方面進(jìn)行感官評價(jià)[7]。

1.2.4 菌種后酸化能力測定

將發(fā)酵至70°T的酸奶分裝置于6℃冰箱冷藏，測定第1、5、10、15、20、25 d的酸度,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。

1.2.5 菌種持水力測定

取10 mL酸奶放入離心管中。離心管質(zhì)量記為w1，加入酸奶后的質(zhì)量記為w2，離心速度為6 000 r/min，離心10 min，靜置10 min，吸去上清液，此時(shí)質(zhì)量記為w3。持水性計(jì)算公式：M=(w3-w1)/(w2-w1)×100%。

1.2.6 蛋白水解能力的測定

通過文獻(xiàn)提供的OPA法測定菌種的蛋白水解能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌的分離鑒定

將得到的16 SrDNA測序結(jié)果提交到NCBI上進(jìn)行序列比對，選取相似度較高的模式菌株作為對比，用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行聚類性分析，得到的系統(tǒng)發(fā)育樹如下圖1所示。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，所選擇的16株鏈球菌已報(bào)道的模式菌Streptococcus thermophilusATCC19258親緣關(guān)系最為接近，在NCBI上比對其相似度均在98%以上，因此可以將篩選的16株菌確定為嗜熱鏈球菌，并依次命名為T1-T16。嗜熱鏈球菌是國家規(guī)定的可用于食品的菌種之一，酸奶發(fā)酵的主要作用菌，對酸奶發(fā)酵周期、酸奶質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味起著決定性的作用，篩選優(yōu)良的嗜熱鏈球菌資源對于開發(fā)直投式酸奶發(fā)酵劑具有十分重要的意義。

圖1 分離得到的細(xì)菌的16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 分離菌發(fā)酵性能研究

2.2.1 酸奶發(fā)酵測試

較快的產(chǎn)酸速度一般有利于工業(yè)化生產(chǎn)，例如，可以縮短生產(chǎn)周期，增加產(chǎn)能，但過快的發(fā)酵速度可能會帶來乳清析出的不良影響。實(shí)驗(yàn)評估了16株篩選的嗜熱鏈球菌發(fā)酵酸奶至70°T所需要的時(shí)間，同時(shí)評價(jià)了冷藏后熟后酸奶的口感和風(fēng)味。如圖2所示，不同菌株產(chǎn)酸速度差異明顯，發(fā)酵速度最快的是T 13，270 min即到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)，其次是T 5，T6，T9，T 16。但T 13感官評分不高，主要體現(xiàn)在風(fēng)味欠缺，如表1所示，可能跟黏度有關(guān)系，一般來說黏度較高的菌，風(fēng)味相對較弱，但高黏度的菌種可以減少攪拌型酸奶增稠劑的使用，較好的保留酸奶質(zhì)構(gòu)，在實(shí)際生產(chǎn)中可以跟產(chǎn)香較好的菌種搭配使用。綜合評價(jià)T4，T 6，T 8，T 9，T 12，T14，T 16感官評分較高。

圖2 不同菌株發(fā)酵過程中酸奶酸度變化

表1 乳酸菌的篩選結(jié)果

2.2.2 單菌后酸能力分析

由圖3可知，隨著冷藏時(shí)間的延長，這16株菌發(fā)酵的酸奶的酸度均呈現(xiàn)出上升趨勢，不同菌株的后酸化能力差異也比較明顯，其中菌株T13的后酸化最明顯，酸度增加了21°T，說明其后酸化能力最強(qiáng)，菌株T 9和T 16冷藏期間酸度變化最小，4℃冷藏20 d后酸度僅增加了9°T，說明后酸化能力弱，符合優(yōu)良乳酸菌發(fā)酵劑具有的特點(diǎn)，其余菌株后酸化能力差異不明顯，儲藏20天后，酸度一般增加11～15°T。

圖3 冷藏過程中酸度變化

2.2.3 單菌株持水性測定

菌株的持水性與發(fā)酵乳的品質(zhì)密切相關(guān)，研究表明單菌株的持水性越高，酸乳對水的保持性越高，從而乳清的析出也會大大降低，有利于提高酸乳的品質(zhì)。由表2可知，菌株T9和T16的持水性較高，這兩株菌發(fā)酵酸奶后乳清析出極少，T1次之，T8持水性最低，有少量的乳清析出現(xiàn)象，與前面感官評價(jià)結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)表明，其持水性較高，發(fā)酵酸奶的的品質(zhì)也較為稠厚，黏度較高，乳清析出較少，適用于制作高黏稠厚質(zhì)感的酸乳。

表2 單菌株的持水性

2.2.5 單菌株的蛋白水解能力

蛋白質(zhì)的水解是產(chǎn)生各種風(fēng)味物質(zhì)的主要途徑，發(fā)酵乳制品蛋白的水解可以增加酸奶的風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值，但過度的水解也會影響酸奶的質(zhì)地，因此適度的蛋白水解對改善酸奶風(fēng)味和質(zhì)地以及生成活性肽具有重要作用。因此本實(shí)驗(yàn)采用OPA法測定菌株的水解蛋白能力，以便進(jìn)一步篩選出優(yōu)良的發(fā)酵乳菌株。

由表4可以看出，不同的菌株蛋白水解能力差異很大，這可能與菌株本身的酶系有關(guān)，其中菌株T13蛋白水解能力最強(qiáng)，發(fā)酵結(jié)束后亮氨酸含量為559.52 mg/mL，但感官評分不高，可能與蛋白水解過度有關(guān)，菌株T 9具有良好的蛋白水解能力，發(fā)酵6 h后，亮氨酸含量達(dá)到451.59 mg/mL，然后依次是T 16和T7，而T1和T12的蛋白水解能力保持在相對較低的水平，可能與乳酸菌自身代謝有關(guān)，利用了部分氨基酸，具體機(jī)理還有待探究。

表3 菌株的蛋白水解能力

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品奶豆腐，通過初篩和復(fù)篩，挑選出16株發(fā)酵性能良好的嗜熱鏈球菌(T1～T16)，并結(jié)合鏡檢觀察、生化試驗(yàn)以及16SrDNA基因序列分析對菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示這16株菌發(fā)酵酸乳至70°T所需時(shí)間為4-8 h，各菌株在產(chǎn)酸、持水性以及蛋白水解能力存在差異。菌株T 9和T16各方面的性能均比較好，具有良好的產(chǎn)酸能力，后酸能力弱，并且持水性和蛋白水解能力均比較好，制備的發(fā)酵乳酸奶風(fēng)味濃郁，口感優(yōu)越，質(zhì)地良好，可用于開發(fā)具有良好發(fā)酵特性的直投式酸奶發(fā)酵劑。