周鮮嬌，楊勇捷，黃施華，潘進(jìn)權(quán)，陳蓉，饒穎竹

（嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048）

0 引 言

百香果(Passionfruit)為西番蓮科(Passifloraceaee)西番蓮屬(Passiflora L.)，是一種多年生常綠藤本植物的果實(shí)[1,2]，其營(yíng)養(yǎng)豐富[3]，香氣濃郁，口感酸甜，保健功效好，適宜各類人群食用[4]。

酸奶富含各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、活性物質(zhì)及活性乳酸菌等，可促進(jìn)人體腸道內(nèi)乳酸菌的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)人體腸道中的微生物菌群平衡，改善腸道功能。Tomas-MSJ等[5]和Arakawa等[6]研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌產(chǎn)生細(xì)菌素對(duì)致病菌有顯著的抑制作用，具有清腸道、降固醇、預(yù)防老年人心血管疾病等保健功效。近年來(lái)，我國(guó)酸奶產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，各種果蔬和糧食等口味的風(fēng)味酸奶[7-10]應(yīng)運(yùn)而生，相比于蔬和糧食酸奶，百香果營(yíng)養(yǎng)豐富和香味獨(dú)特—百果之香，這使其更適合作為風(fēng)味酸奶制作的原料之一。百香果酸奶具有色、香、味等口感俱全的特色，其營(yíng)養(yǎng)也更全面。目前，對(duì)于百香果酸奶的研究報(bào)道鮮見(jiàn)[3]本研究通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化百香果酸奶發(fā)酵工藝，旨在分析出百香果酸奶的最優(yōu)發(fā)酵條件，為百香果風(fēng)味酸奶的研制提供科學(xué)的工藝參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

奶粉(伊利牌高蛋白脫脂高鈣奶粉)，百香果(市售新鮮紫香百香果),白砂糖；菌粉：川秀乳酸菌酸奶發(fā)酵粉（保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)：嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)為1∶1）。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS肉湯，結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)，煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯。

1.1.3 儀器設(shè)備

SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌器，SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)，SQP電子天平，BCD-402WDBA海爾冰箱。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程及操作要點(diǎn)

取百香果果肉搗碎，經(jīng)無(wú)菌紗布過(guò)濾留汁并殺菌冷卻，得百香果果汁；將脫脂奶粉與白糖混合、溶解，并殺菌冷卻，得無(wú)菌奶液；菌粉用溫開(kāi)水溶解，以備接種。

1.2.2 百香果酸奶制作流程

混勻果汁、無(wú)菌奶液→接種→混勻→分裝→發(fā)酵→4℃冷藏24 h后熟→成品

混勻

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

發(fā)酵時(shí)間設(shè)定為5 h時(shí)，分別比較不同奶粉添加量（6 g/100 mL、9 g/100 mL、12 g/100 mL、15 g/100 mL、18 g/100 mL）白糖添加量（5 g/100 mL、7 g/100 mL、9 g/100 mL、11 g/100 mL、13 g/100 mL）、百香果果汁添加量（0%、2%、4%、6%、8%）、發(fā)酵溫度（40℃、41℃、42℃、43℃、44℃）和菌粉添加量（1∶500、1∶1000、1∶1500、1∶2000、1∶2500，均為質(zhì)量體積比）對(duì)百香果酸奶品質(zhì)的影響。

1.2.4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以百香果酸奶感官評(píng)分為響應(yīng)值，利用Design-Expert.V8.0.6進(jìn)行PB試驗(yàn)的設(shè)計(jì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 PB試驗(yàn)因素與水平

1.2.5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在PB實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)篩選得出的顯著因子進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，從而獲得最佳工藝區(qū)域的方法，并將此最佳結(jié)果作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)展開(kāi)實(shí)驗(yàn)[11]。

1.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)因素及對(duì)應(yīng)水平如表2所示。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.2.7 酸奶測(cè)定項(xiàng)目及標(biāo)準(zhǔn)

1.2.7.1 感官評(píng)定

隨機(jī)邀請(qǐng)10位同學(xué)組成鑒評(píng)小組，參照國(guó)家酸乳衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T19302-2010[12]，根據(jù)成品的色澤、滋味、氣味、狀態(tài)等進(jìn)行綜合評(píng)分。除去一個(gè)最高分和一個(gè)最低分后取平均值作為最后感官評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表3所示。

表3 感官指標(biāo)評(píng)定

1.2.7.2 理化和微生物指標(biāo)

酸度數(shù)值以°T表示，具體操作方法見(jiàn)GB/T 5413.34-2010[19]。乳酸菌數(shù)≥1×106mL-1，方法詳見(jiàn)GB/T 4789.35-2016[23]；大腸菌群（最近似值）≤0.003 mL-1，方法詳見(jiàn)GB/T 4789.3-2008[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 百香果果汁添加量的確定

由圖1可以看出，百香果果汁添加量對(duì)酸奶的品質(zhì)有明顯影響,感官評(píng)分隨百香果汁添加量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)不添加果汁時(shí)，酸奶風(fēng)味較淡，感官評(píng)分為68；當(dāng)添加量為6%時(shí)，酸奶具有百香果獨(dú)特香味、凝乳好、口感佳，感官評(píng)分最高，為84分；當(dāng)添加量達(dá)到8%時(shí)，酸奶較粗糙，缺少細(xì)膩感，綜合品質(zhì)明顯降低。因此，6%的果汁添加量最佳。

圖1 百香果果汁添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響

2.1.2 奶粉添加量的確定

圖2表明，脫脂奶粉添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響很大,感官評(píng)分隨脫脂奶粉添加量的增加呈先升高后緩慢降低的趨勢(shì)。奶粉添加量為6%和9%時(shí)，酸奶有大量乳清析出，凝乳不均勻；奶粉添加量小于12%時(shí)，增加奶粉的添加量可使酸奶更具稠厚感，凝乳更均勻，口感更細(xì)膩，酸奶品質(zhì)明顯提高；但當(dāng)奶粉添加量大于12%時(shí)，奶粉添加量對(duì)酸奶的品質(zhì)影響不顯著，感官評(píng)分差值不大，因此以12%奶粉添加量為最佳值。

2.1.3 白糖添加量的確定

圖3可以看出，白糖添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響極為明顯。感官評(píng)分隨白糖添加量的添加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，白糖添加量為7%時(shí)，感官評(píng)分最高；當(dāng)糖添加量增至9%時(shí)，酸奶口感過(guò)甜；添加量為13%時(shí)，酸奶凝乳不均勻、稠厚感差、甜度無(wú)法適口。因此7%的糖添加量最為合適。

圖2 脫脂奶粉添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響

圖3 白糖添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響

2.1.4 發(fā)酵溫度的確定

由圖4可以看出，發(fā)酵溫度對(duì)酸奶品質(zhì)的影響較大，高于43℃時(shí)，酸奶品質(zhì)劇急下降；發(fā)酵溫度42℃時(shí)，酸奶口感和組織機(jī)構(gòu)最佳，評(píng)分85最高；發(fā)酵溫度43℃時(shí)，酸奶口感潤(rùn)滑度下降，發(fā)酵溫度44℃時(shí)，酸奶則產(chǎn)生大量乳清，凝乳不均勻，酸奶原有香味改變。因此選擇42℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)酸奶品質(zhì)的影響

2.1.5 菌粉添加量的確定

由圖5可以看出，當(dāng)菌粉與奶果混合液1∶1000（質(zhì)量濃度比）混合發(fā)酵時(shí)，酸奶凝乳最好，感官評(píng)分為86分；而在菌種添加量遞減過(guò)程中，酸奶品質(zhì)隨之下降；當(dāng)添加量為菌粉∶混合液=1∶2500時(shí)，酸奶凝乳不均勻，香味不明顯，口感稀薄，綜合品質(zhì)最差。因而可得，菌粉最佳添加量為1∶1000。

2.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表4和表5為PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。由表5可以看出，PB實(shí)驗(yàn)的模型P值為0.0004（小于0.01），達(dá)到極顯著，該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從各因素的P值可知，各因素對(duì)酸奶品質(zhì)的影響力從高到低為果汁添加量＞白糖添加量＞發(fā)酵溫度＞奶粉添加量＞菌粉添加量，其中果汁添加量、白糖添加量、發(fā)酵溫度達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。從系數(shù)估值可知，白糖添加量和發(fā)酵溫度對(duì)酸奶品質(zhì)呈正效應(yīng)影響，其余因素為負(fù)效應(yīng)影響。選擇Box-Behnken試驗(yàn)時(shí)至少需要3個(gè)因素，因此，結(jié)合各因素的P值大小，選擇果汁添加量、白糖添加量和發(fā)酵溫度這3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。

圖5 菌粉添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表5 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

從PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，白糖添加量和發(fā)酵溫度為正效應(yīng)，果汁添加量為負(fù)效應(yīng)，則適當(dāng)提高白糖添加量和發(fā)酵溫度，減小果汁添加量有利于提高酸奶品質(zhì)。最陡爬坡試驗(yàn)是根據(jù)因素的正負(fù)效應(yīng)及實(shí)際情況，確定爬坡方向和合理的步長(zhǎng)，以達(dá)到快速逼近最佳區(qū)域的目的。由表6可知，最佳的組合為實(shí)驗(yàn)號(hào)2，即果汁添加量為5.5%、白糖添加量為7.5%、發(fā)酵溫度42.5℃，故以實(shí)驗(yàn)號(hào)2的條件為Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心值。

表6 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表7所示。

表7 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析

在PB實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果如表7所示；方差分析如表8所示。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到響應(yīng)面回歸模擬方程為感官評(píng)分=+93.40+0.75A－1.62B+1.88E+0.75AB－1.25AE－1.00BC－1.95A2－3.20B2－3.20E2。由表8可以看出，模型P＜0.0001，達(dá)極顯著。失擬項(xiàng)P=0.1234＞0.1，不顯著，表明模型對(duì)本試驗(yàn)的擬合度良好?；貧w系數(shù)R2=0.9758，模型擬合度良好，R2Adj=0.9448，說(shuō)明該模型能解釋94.48%響應(yīng)值的變化，可用于百香果酸奶發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化。由各因素的P值可知，交互項(xiàng)AE，BE和一次項(xiàng)A(P＜0.05)影響顯著；B，E，A2，B2和E2影響均達(dá)極顯著(P＜0.01)；結(jié)果說(shuō)明該3個(gè)因素對(duì)百香果酸奶發(fā)酵的影響顯著，且存在交互作用。

表8 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析

2.4.2 響應(yīng)面分析

從圖6的響應(yīng)面圖可知本實(shí)驗(yàn)的模型存在最大值，依據(jù)模型擬合結(jié)果，百香果酸奶發(fā)酵的最佳工藝為：果汁添加量5.51%，白糖添加量7.35%，發(fā)酵溫度42.67℃，百香果酸奶的感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為93.9705。為便于操作，修訂發(fā)酵工藝參數(shù)為：果汁添加量5.5%，白糖添加量7.4%，發(fā)酵溫度42.7℃。在此條件下，百香果酸奶的感官評(píng)分達(dá)到94.33分，與預(yù)測(cè)值接近。

圖6的等高線圖可直觀地反映出2個(gè)變量對(duì)百香果酸奶品質(zhì)的影響顯著程度，三個(gè)等高線圖顯示這三個(gè)因素兩兩均存在著交互作用，且交互作用顯著。

2.5 酸奶成品質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

2.5.1 感觀評(píng)價(jià)

按照響應(yīng)面法得出最佳的發(fā)酵工藝，發(fā)酵得出百香果酸奶色澤均勻，為淺黃色；組織細(xì)膩，凝乳均勻，口感潤(rùn)滑，僅有極少量乳清析出，無(wú)分層、氣泡；乳香和百香果特有香味濃郁，氣味清新，且甜度適口，感官評(píng)分達(dá)94.33。

2.5.2 理化與微生物檢測(cè)結(jié)果

成品酸度為73°T，乳酸菌為5.8×108mL-1，大腸桿菌沒(méi)有檢出。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵法確定了百香果酸奶最佳發(fā)酵工藝。結(jié)果表明：以果汁添加量、白砂糖添加量和發(fā)酵溫度為自變量，響應(yīng)面法優(yōu)化得出百香果酸奶的最佳發(fā)酵工藝為白糖添加量7.4%，接種量0.1%，百香果果汁添加量5.5%，發(fā)酵溫度42.7℃，發(fā)酵時(shí)間5 h。在此條件下，酸奶感官評(píng)分約達(dá)到94.33分，與預(yù)測(cè)值（93.9705分）基本相符，此結(jié)果可充分驗(yàn)證該試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃?。?shí)驗(yàn)檢測(cè)出百香果酸奶的酸度為73°T，乳酸菌檢測(cè)數(shù)為5.8×108mL-1，大腸桿菌沒(méi)有檢測(cè)出。本實(shí)驗(yàn)研制的百香果酸奶的品質(zhì)完全符合國(guó)家發(fā)酵乳的標(biāo)準(zhǔn)[15]。

圖6 兩兩因素交互作用對(duì)酸奶品質(zhì)影響的響應(yīng)面與等高線圖