劉平，任秋婧，康馨，張媛媛，林曉蓉，李斌，高雄，陳忠正

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642

茶是世界三大無酒精飲料之一，含有茶多酚、生物堿、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)、茶多糖、有機(jī)酸等700多種藥理活性物質(zhì)及營養(yǎng)成分?？Х葔A是茶葉的主要生物堿，約占干物質(zhì)含量的2%～4%，具提神醒腦、促消化、強(qiáng)心、解熱鎮(zhèn)痛等功效[1-2]。已有研究表明，植物體內(nèi)咖啡堿生物合成的核心途徑為：黃嘌呤核苷→7-甲基黃嘌呤核苷→7-甲基黃嘌呤→可可堿→咖啡堿，N-甲基轉(zhuǎn)移酶（NMT）是催化其3步轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)合成咖啡堿的關(guān)鍵酶[3]。NMT基因的克隆始于Moisyadi等[4]對咖啡植物的報(bào)道，其克隆到的黃嘌呤核苷N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因具有催化咖啡堿合成第一步轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)的功能。茶葉中NMT基因的克隆最早由Kato等[5]在2000年報(bào)道，其克隆到的TCS1（AB031280）具有后兩步轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)的功能。其后國內(nèi)外研究者包括本課題組相繼在茶葉、咖啡、可可等植物中克隆出多個(gè)具不同催化功能的NMT[6-8]，從基因角度證明 NMT基因具有家族性，咖啡堿/可可堿的合成是在多個(gè)NMT基因的作用下合成。

啟動子是啟動功能基因轉(zhuǎn)錄的重要部件，也是靶基因調(diào)控中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合并實(shí)施調(diào)控的重要元件，很多重要功能基因的啟動子包括水稻、擬南芥等植物已進(jìn)行了大量研究[9-11]。NMT作為咖啡堿合成的關(guān)鍵酶，已有報(bào)道多集中于NMT基因尤其cDNA的克隆，基因啟動子的研究報(bào)道較少。2005年，Satyanarayana等[12]用PCR技術(shù)從咖啡植物中分離出NMT基因的啟動子，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在煙草中測定了克隆啟動子的功能。茶樹作為含咖啡堿植物，雖然在咖啡堿合成的NMT基因啟動子研究方面有報(bào)道，但均停留在啟動子序列分離階段[7,13]，尚未見對其功能研究的報(bào)道。本課題組前期在克隆茶葉NMT基因的過程中，從英紅9號茶樹 cDNA文庫篩選獲得多個(gè)高度同源但具不同催化功能的NMT基因[8]，其中命名為NMT1的基因功能非常類似報(bào)道的TCS1，并發(fā)現(xiàn)僅NMT1基因會與同材料中克隆的其他NMT基因存在蛋白互作，基因表現(xiàn)非常特殊[14]。因此，本研究在克隆NMT系列基因基礎(chǔ)上，利用 hiTAIL-PCR法從英紅 9號茶樹克隆YH-NMT1基因啟動子，通過生物信息學(xué)分析其順式作用元件，借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究該啟動子的功能特性及環(huán)境脅迫對其功能的影響。研究的開展將為了解 NMT1基因啟動子在植物發(fā)育過程中的表達(dá)模式提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為研究NMT基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控及培育特定咖啡堿含量茶樹提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

英紅9號春季一芽二葉嫩梢，采于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)基地，液氮冷凍后-80℃保存?zhèn)溆?；煙草組培苗、大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌菌株 GV3101和植物雙元表達(dá)載體pBI121由本實(shí)驗(yàn)室保存；T4DNA連接酶、LA Taq DNA聚合酶、XbaI、Hind III限制性內(nèi)切酶、DNA marker購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物合成和DNA測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R高速離心機(jī)、Mastercyler pros基因擴(kuò)增儀（德國Eppendorf公司），U410-86超低溫冰箱（美國NBS公司），GHP-9080培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），MK20E恒溫金屬?。ê贾輮W盛儀器有限公司），分析天平（Mettler Toledo公司），Milli-Q Integral 3純水系統(tǒng)（美國 Milli-pore公司），XB-40制冰機(jī)（美國Grant公司），Bio-rad電泳儀、Gel doc XR+成像儀（美國 Bio-rad公司），OLYMPUS SZX16體視顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 NMT1基因啟動子克隆與序列生物信息學(xué)分析

茶樹基因組 DNA提取采用改良 CTAB法；啟動子擴(kuò)增按照文獻(xiàn)[15]的 hiTAIL-PCR法，即以YH-NMT1基因5'端序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)3條特異的巢式引物S1-0、S1-1和S1-2，結(jié)合4條LAD簡并引物及AC1（表1）進(jìn)行3輪巢式PCR擴(kuò)增。首輪擴(kuò)增以50 ng的茶葉基因組DNA為模板，以S1-0和LAD1—LAD4引物進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍后用S1-1和 AC1引物組合進(jìn)行第 2輪擴(kuò)增；再將第 2輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋 10倍為模板用 S1-2和 AC1引物組合進(jìn)行第3輪擴(kuò)增，完成第1次擴(kuò)增。第 1次擴(kuò)增產(chǎn)物測序后，根據(jù)序列特點(diǎn)在其5'端再設(shè)計(jì) 3個(gè)特異性巢式 PCR引物 S2-0、S2-1、S2-2，結(jié)合4條LAD簡并引物及AC1（表1）同上進(jìn)行第2次擴(kuò)增并測序。兩次擴(kuò)增產(chǎn)物PCR拼接驗(yàn)證克隆后連接至pMD18-T載體轉(zhuǎn)化大腸肝菌DH5α并篩選出重組子。將得到的啟動子用啟動子在線分析軟件 PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE）和 Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析。

1.3.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果及 CAAT-box、TATA-box等順式作用元件的線性分布，設(shè)計(jì)5'端引入Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)的引物 pA-F、pB-F、pC-F、pD-F和 5'端引入XbaI酶切位點(diǎn)的引物p-R（表2），以鑒定含克隆啟動子的重組子為模板，用引物組合 pA-F/p-R、pB-F/p-R、pC-F/p-R、pD-F/p-R分別擴(kuò)增 5'端序列依次缺失的4個(gè)啟動子。擴(kuò)增引物經(jīng)XbaI、Hind Ⅲ雙酶切后，插入經(jīng)同樣酶切回收的pBI121載體以替換其CaMV35S啟動子。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α并將篩選到的重組子進(jìn)行PCR和測序鑒定，構(gòu)建出4個(gè)5'端序列依次缺失的克隆啟動子融合GUS基因的轉(zhuǎn)基因載體pA、pB、pC、pD（圖1）。

表1 hiTAIL-PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primers of hiTAIL-PCR

表2 載體構(gòu)建PCR擴(kuò)增引物Table 2 Primers of PCR in the vector construction

1.3.3 GUS瞬時(shí)表達(dá)分析

將構(gòu)建好的4個(gè)重組載體和pBI121載體分別用熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株，參照吳英杰等[16]的方法進(jìn)行GUS瞬時(shí)表達(dá)分析。即用農(nóng)桿菌滲透法侵染煙草葉片，浸染過的外植體接種在共培養(yǎng)基（1/2 MS+120 μmol·L-1AS）上，28℃暗培養(yǎng)2～3 d后GUS染色，GUS組織化學(xué)染色參照J(rèn)efferson等[17]的方法，略有改動，染色結(jié)束后用75%的乙醇脫色處理至陰性對照為白色，用體視顯微鏡進(jìn)行觀察并照相。

1.3.4 煙草遺傳轉(zhuǎn)化與陽性植株篩選鑒定

將含有 pA和 pBI121的農(nóng)桿菌 GV3101菌株，用葉盤轉(zhuǎn)化法[18]分別對煙草轉(zhuǎn)基因，經(jīng)篩選培養(yǎng)（MS+200 mg·L-1Carb+75 mg·L-1Kan）獲得抗性植株。對抗性植株采用CTAB法提取基因組 DNA為模板，以未轉(zhuǎn)基因煙草為陰性對照，用引物 GUS-F：TCGGCTTTAACCTCTCTTTAG；GUS-R：ATTGTTTGCCTCCCTGCT對其 GUS基因擴(kuò)增分析鑒定轉(zhuǎn)基因植株。

圖1 植物表達(dá)載體構(gòu)建Fig. 1 Construction of plant expression vector

1.3.5 轉(zhuǎn)基因煙草組織 GUS化學(xué)染色及 GUS基因表達(dá)量分析

參照 Jefferson等[17]的方法對鑒定的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行根、莖、葉的GUS組織化學(xué)染色，并用體視顯微鏡進(jìn)行觀察并照相。轉(zhuǎn)基因煙草不同組織GUS基因表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，即以提取的各組織總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，用引物F：5'-CTCATTACGGCAAAGTG TGGGTCAA-3'和 R：5'-CAATAACATACGGC GTGACATCGG-3'擴(kuò)增分析 GUS基因 mRNA表達(dá)量，以煙草β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因。

1.3.6 不同脅迫處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因煙草葉片GUS基因的表達(dá)分析

為檢測轉(zhuǎn)基因植株在不同脅迫處理?xiàng)l件下GUS基因的表達(dá)情況，以轉(zhuǎn)基因植株處理前的材料為對照（CK），對材料作如下處理：（1）正常條件下培養(yǎng)48 h（每天2 000 lux光照 16 h，8 h黑暗，25℃培養(yǎng)）；（2）黑暗及光照處理：將煙草苗置于黑暗條件下及2 000 Lux光照培養(yǎng)各48 h；（3）高低溫處理：將煙草苗分別置于4℃和40℃培養(yǎng)48 h；（4）干旱處理：澆灌濃度為 30%的聚乙二醇（PEG6000）模擬干旱脅迫，培養(yǎng)48 h；（5）ABA 處理：100 μmol·L-1ABA 噴灑于煙草苗葉片上，培養(yǎng)48 h。將對照材料及處理后的材料分別取葉片，立即用液氮速凍，并提取總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測GUS基因的表達(dá)情況，方法同1.3.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉DNA提取及NMT1基因啟動子克隆

采用改良 CTAB法提取茶樹葉片基因組DNA，以提取的 DNA 為模板進(jìn)行hiTAIL-PCR。第1次hiTAIL-PCR利用巢式特異引物組合 LAD2引物成功擴(kuò)增獲得 500 bp片段（圖1），測序分析后在其5'端再設(shè)計(jì)3個(gè)特異巢式引物進(jìn)行第 2次 hiTAIL-PCR擴(kuò)增，結(jié)果利用特異引物組合LAD3引物成功擴(kuò)增獲得5'端延伸的約500 bp新片段（圖2），將兩輪擴(kuò)增的序列據(jù)重復(fù)區(qū)拼接后獲得啟動子序列。按拼接啟動子序列5'端和3'端序列再設(shè)計(jì)特異引物從基因組中直接擴(kuò)增靶啟動子序列，結(jié)果得到的序列完全等同拼接的啟動子序列，驗(yàn)證了克隆啟動子的正確性，克隆的NMT1基因啟動子序列長767 bp（圖3）。

2.2 啟動子序列分析及順式作用元件預(yù)測

利用啟動子在線預(yù)測數(shù)據(jù)庫Plant Care和PLACE對克隆的NMT1基因啟動子序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明（圖4和表3），PNMT1序列中預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) TSS位于翻譯起始位點(diǎn)上游63 bp的堿基A處。該啟動子除具有真核生物啟動子的基本結(jié)構(gòu) TATA-BOX 和CAAT-BOX等核心元件，還含有脫落酸響應(yīng)元件ABRE，厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件 ARE，茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif，熱應(yīng)答元件HSE，乙烯應(yīng)答元件ERE，脅迫相關(guān)應(yīng)答元件TC-rich repeats，水楊酸響應(yīng)元件TCA-element，以及多個(gè)光應(yīng)答元件如AE-box、ATC-motif、Box-4、Box I、as-2-box 等。

圖2 hiTAIL-PCR的第2輪和第3輪Fig. 2 Secondary and third amplification of hiTAIL-PCR

2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

據(jù)克隆NMT1基因啟動子元件分析結(jié)果，設(shè)計(jì)4對特異引物擴(kuò)增5'端序列依次缺失的啟動子各 767、452、352、210 bp，通過重組將各啟動子片段插入到 pBI121載體，替換其GUS基因上游的CaMV35S啟動子以構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體。將構(gòu)建的重組載體質(zhì)粒進(jìn)行 PCR鑒定，結(jié)果如圖5所示，各重組質(zhì)粒中擴(kuò)增出預(yù)期大小的啟動子片段大小與預(yù)期一致，經(jīng)測序驗(yàn)證表明克隆啟動子與 GUS融合的轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建成功，分別命名為pA、pB、pC、pD。

2.4 GUS瞬時(shí)表達(dá)分析

以含pBI121的GV3101菌株為陽性對照，空GV3101菌株為陰性對照CK，將pA、pB、pC、pD重組載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 GV3101，利用滲透法浸染煙草葉片，經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行GUS染色。結(jié)果表明，除CK未觀察到染上藍(lán)色外，其他載體轉(zhuǎn)化葉片皆染上藍(lán)色。4個(gè)重組載體載體轉(zhuǎn)化的煙草葉片隨插入啟動子長度的增加染色加深，以含全長啟動子的pA載體轉(zhuǎn)化葉片染色明顯深于其他 3個(gè)。陽性對照即pBI121轉(zhuǎn)化葉片在所有轉(zhuǎn)化葉片中染色最深（圖6）。瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明所克隆的NMT1基因啟動子具驅(qū)動GUS基因表達(dá)的功能，且以全長啟動子驅(qū)動能力最強(qiáng)。

圖3 NMT1基因啟動子的PCR擴(kuò)增Fig. 3 Amplification of NMT1 promoter

圖4 PNMT1的序列分析Fig. 4 Sequence analysis of PNMT1

表3 啟動子調(diào)控區(qū)元件分析Table 3 Cis-acting regulatory element analysis of the promoter sequence

2.5 轉(zhuǎn)基因煙草植株篩選鑒定

根據(jù)瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果，選取含 NMT1基因全長啟動子的pA載體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草，以pBI121載體為陽性對照，經(jīng)篩選獲得抗性植株。對各抗性植株提取葉片DNA，以非轉(zhuǎn)基因煙草為陰性對照（CK），進(jìn)行GUS基因的PCR檢測，結(jié)果在選取的50株抗性植株中有37株擴(kuò)增出預(yù)期GUS基因片段，而非轉(zhuǎn)基因煙草未擴(kuò)增出任何片段（圖7），表明煙草轉(zhuǎn)基因成功。

2.6 轉(zhuǎn)基因煙草組織GUS化學(xué)染色及GUS基因表達(dá)量分析

選取鑒定的pA轉(zhuǎn)基因煙草植株和非轉(zhuǎn)基因煙草，分別對其根、莖、葉進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果表明（圖8），非轉(zhuǎn)基因煙草各組織均無藍(lán)色斑點(diǎn)，轉(zhuǎn)基因煙草的根、莖、葉均檢測到藍(lán)色斑點(diǎn)，表明PNMT1啟動子在煙草中驅(qū)動GUS基因表達(dá)無組織特異性。采用定量PCR對轉(zhuǎn)基因煙草根、莖、葉中的GUS基因表達(dá)量進(jìn)行分析（圖9），結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草不同組織中GUS基因表達(dá)量具顯著差異，根部的表達(dá)量最少，莖部的表達(dá)量居中，約為根部的1.5倍，而葉片中的表達(dá)量最高，達(dá)到根部的3倍。

圖5 重組質(zhì)粒PCR鑒定Fig. 5 Identification of recombinant plasmid with PCR

2.7 不同脅迫處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因煙草葉片GUS基因的表達(dá)分析

為探明克隆啟動子的驅(qū)動能力與外界環(huán)境脅迫因子的關(guān)系，將 pA和 pBI121轉(zhuǎn)基因煙草分別進(jìn)行不同程度的光照、溫度、干旱、激素等脅迫處理，并對處理前后的煙草葉片分別進(jìn)行GUS基因表達(dá)量的分析，結(jié)果如圖10。

由圖10可知，pA轉(zhuǎn)基因煙草正常生長48 h后GUS表達(dá)量均無顯著差異，經(jīng)黑暗、4℃低溫處理48 h后，GUS表達(dá)量均降低約為處理前的40%；經(jīng)光照、30%PEG、ABA處理48 h后，GUS表達(dá)量分別升高約為處理前的1.4、1.4、1.6倍；經(jīng)40℃處理48 h后，GUS表達(dá)量較處理前無顯著差異。而陽性對照pBI121轉(zhuǎn)基因煙草在不同條件處理前后GUS表達(dá)量均無顯著差異。由以上結(jié)果可知，克隆的 NMT1基因啟動子驅(qū)動外源基因表達(dá)受外界環(huán)境因子的脅迫影響。

圖6 GUS瞬時(shí)表達(dá)檢測Fig. 6 Detection of GUS transient expression activity

圖7 部分轉(zhuǎn)基因煙草基PCR鑒定Fig. 7 The identification of partial transgenic tobacco with PCR

圖8 轉(zhuǎn)基因煙草組織GUS表達(dá)檢測Fig. 8 Detection of GUS expression activity in transgenic tobacco tissues

圖9 轉(zhuǎn)基因煙草組織GUS基因表達(dá)量分析Fig. 9 Analysis of GUS gene expression level in transgenic tobacco tissues

圖10 不同處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因煙草GUS基因表達(dá)量分析Fig. 10 Analysis of GUS gene expression level in transgenic tobacco under different conditions

3 討論

啟動子在功能基因的表達(dá)與調(diào)控方面起著重要作用，啟動子分離及相關(guān)研究一直是分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。在啟動子分離方面，因所研究材料的基礎(chǔ)背景不同呈現(xiàn)技術(shù)多樣化。對全基因組已測序的生物，經(jīng)設(shè)計(jì)特異引物即可擴(kuò)增獲得啟動子，如 Yang等[19]對擬南芥pGC1基因啟動子的克隆。對于沒有基因組信息的生物，啟動子分離技術(shù)主要包括兩類：通過構(gòu)建基因組文庫再篩選出啟動子，或是利用TAIL-PCR等側(cè)翼序列擴(kuò)增技術(shù)分離啟動子。Tai等[13]通過構(gòu)建基因組文庫篩選克隆了茶樹LAR、TCS、TS基因啟動子。但基因組文庫構(gòu)建由于難度高、工作量大，限制了在啟動子克隆上的應(yīng)用。以 TAIL-PCR及其改良hiTAIL-PCR[15]為代表的靶基因側(cè)翼序列分離技術(shù)，因具有簡單快捷的優(yōu)點(diǎn)，在啟動子的分離上成功得到應(yīng)用[20-21]。在本研究中，針對茶葉沒有詳細(xì)基因組信息可借鑒的客觀情況，采用hiTAIL-PCR技術(shù)對茶樹咖啡堿合成酶家族成員 NMT1基因的啟動子進(jìn)行克隆，成功獲得靶基因的上游啟動子序列，經(jīng)NewPLACE、Plant CARE等[22-24]多個(gè)在線分析軟件的分析預(yù)測，表明所分離的序列含有 TATA-box、CAAT-box等真核生物啟動子基本元件及多個(gè)與植物非生物脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件，確認(rèn)克隆到靶基因的啟動子，證明了所用技術(shù)的高效便捷性。

對分離到的啟動子進(jìn)行功能測定分析，是啟動子研究的重要內(nèi)容。將啟動子連接報(bào)告基因構(gòu)建表達(dá)載體，通過瞬時(shí)表達(dá)或轉(zhuǎn)基因技術(shù)分析報(bào)告基因在宿主體內(nèi)的表達(dá)特性，可以確定啟動子驅(qū)動基因表達(dá)的特點(diǎn)[25]。有研究表明，啟動子驅(qū)動基因的表達(dá)需要多個(gè)順式調(diào)控元件，這些元件的種類和數(shù)量以及彼此之間的順序、距離，都可能影響基因能否轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄的程度[26-27]。林文秋等[28]在研究菠蘿SERK基因啟動子時(shí)發(fā)現(xiàn)啟動子越長其驅(qū)動報(bào)告基因表達(dá)的活性越強(qiáng)。本研究將克隆的啟動子與GUS基因融合，在煙草葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NMT1基因啟動子越長驅(qū)動GUS基因表達(dá)的活性也越強(qiáng)，印證了前人對相關(guān)啟動子活性研究的結(jié)果。另外，敬帆等[29]對蠟梅CpAGL6基因啟動子功能特性研究發(fā)現(xiàn)，同一啟動子在不同組織部位具有差異的驅(qū)動能力，曹華雯[30]和Li等[31]更是發(fā)現(xiàn)，啟動子的功能還受到干旱、鹽、ABA和低溫等脅迫誘導(dǎo)的影響。本研究對克隆的啟動子研究發(fā)現(xiàn)，其能驅(qū)動報(bào)告基因在轉(zhuǎn)煙草的葉、莖、根中的表達(dá)，但以葉片中表達(dá)最高而根中表達(dá)最低，并發(fā)現(xiàn)其功能受外界環(huán)境脅迫因子包括光照時(shí)間、干旱、激素、溫度的影響，表明本次所分離的啟動子功能雖無組織特異性，但具有組織間差異的驅(qū)動能力，并且其驅(qū)動功能還受外界環(huán)境脅迫因子的影響，體現(xiàn)了克隆啟動子功能表達(dá)的復(fù)雜性。有關(guān) NMT1基因啟動子如何精密驅(qū)動對基因的表達(dá)還在深入研究中。