金莉莉，郝振霞，高貫威，柴云峰，王晨，陳紅平，魯成銀*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 農(nóng)業(yè)部茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（杭州），農(nóng)業(yè)部茶葉質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

茶葉農(nóng)藥殘留一直以來是我國茶葉質(zhì)量安全存在的突出問題，農(nóng)藥殘留不僅危害飲用者的身體健康，同時(shí)嚴(yán)重?fù)p壞了茶葉健康飲品的形象。隨著我國茶葉質(zhì)量安全監(jiān)管水平的逐步提高，農(nóng)藥殘留已成為茶葉質(zhì)量安全監(jiān)測的重要內(nèi)容之一。最新實(shí)施的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中最大農(nóng)藥殘留限量》（GB 2763—2016）中[1]，將GB 2763—2014版中關(guān)于茶葉中的農(nóng)藥MRL值從28項(xiàng)增加至48項(xiàng)，表明我國對(duì)茶葉農(nóng)殘限量的要求正逐步提升。歐盟、日本等對(duì)茶葉中幾百種農(nóng)藥制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，且檢測項(xiàng)目仍不斷增加，限量值逐年降低，對(duì)我國茶葉出口造成了貿(mào)易壁壘[2]。因此，建立茶葉中精準(zhǔn)、高通量的農(nóng)藥殘留分析技術(shù)，有助于在茶葉生產(chǎn)質(zhì)量控制、市場準(zhǔn)入和出口檢驗(yàn)等環(huán)節(jié)中對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行有效的監(jiān)控，從而保障茶葉消費(fèi)安全和茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展安全。

茶葉中多種農(nóng)藥殘留檢測通常采用氣相色譜法、液相色譜法及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3]，具有靈敏度高、選擇性好等特點(diǎn)。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23204—2008和 GB 23200.13—2016中采用氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法，分別提供了茶葉中519和448種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的檢測方法[4-5]。然而茶葉樣品基質(zhì)復(fù)雜，含有茶多酚、色素、咖啡堿等大量干擾物質(zhì)。低分辨質(zhì)譜由于儀器參數(shù)優(yōu)化復(fù)雜、質(zhì)譜信息不充分等缺陷，易受茶葉基質(zhì)干擾，增大了茶葉多農(nóng)殘分析中假陽性誤判的風(fēng)險(xiǎn)[6]。高分辨質(zhì)譜通過全掃描的質(zhì)譜分析方法，可以對(duì)樣品進(jìn)行高通量的目標(biāo)物或非目標(biāo)物篩選，很大程度上減少了樣品基質(zhì)的干擾[7-8]。在此基礎(chǔ)上，靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜將四級(jí)桿與靜電場軌道阱相結(jié)合，一定程度上提高了高分辨質(zhì)譜的定量能力[9]。目前，靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜已廣泛運(yùn)用于蔬菜、水果中的多農(nóng)藥殘留分析，但在茶葉中的應(yīng)用鮮有報(bào)道[9-11]。

本文針對(duì)茶葉基質(zhì)的復(fù)雜性，在優(yōu)化分散固相萃取前處理方法的基礎(chǔ)上，利用超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Orbitrap MS）建立茶葉中21種農(nóng)藥殘留的快速篩選方法，以期為茶葉中多農(nóng)殘檢測提供可靠的分析平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀 Q-Exactive（美國Thermo Fisher公司）；Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜（美國Thermo Fisher公司）；多管渦旋混合儀（杭州米歐儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國 Sigma公司）；Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）。

21種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品和甲霜靈-d6同位素內(nèi)標(biāo)（德國 Dr. Ehrenstorfer公司和上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；乙腈、甲醇（純度98%以上），色譜級(jí)（德國Merck公司）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、強(qiáng)陽離子交換劑（SCX）（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；石墨化碳黑（GCB）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、多壁碳納米管（MWCNTs）（天津博納艾爾公司）；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

茶葉樣品均來自農(nóng)業(yè)部茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室。

1.2 樣品前處理

茶葉樣品粉粹后，過200 μm篩，準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中，加入100 μL 1 mg·L-1的甲霜靈-d6同位素內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋1 min后靜置 30 min，加入 5 mL去離子水渦旋1 min混勻，潤濕后再加入5 mL甲醇，渦旋2 min，以 4 500 r·min-1離心 10 min；移取上清液2 mL至裝有0.4 g PSA和0.4 g SCX粉末的5 mL離心管中，渦旋1 min，以4 500 r·min-1離心 10 min；使用注射器移取凈化后的上清液，經(jīng)親水PTFE針形過濾器（孔徑0.22 μm）過濾至進(jìn)樣瓶中，待上機(jī)檢測。

1.3 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配成1 000 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃以下貯存。采用甲醇和水（V甲醇∶V水=1∶1）稀釋至所需濃度，得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和甲霜靈-d6同位素內(nèi)標(biāo)溶液，配制濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中內(nèi)標(biāo)溶液的質(zhì)量濃度均為 10 μg·L-1。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液：取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和甲霜靈-d6同位素內(nèi)標(biāo)溶液，利用茶葉空白樣品經(jīng)1.2節(jié)處理（不添加內(nèi)標(biāo)）得到的基質(zhì)溶液，稀釋至 1 mL，配制濃度為 0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg·L-1的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中內(nèi)標(biāo)溶液的濃度均為10 μg·L-1。

1.4 儀器條件

UPLC色譜條件：色譜柱采用 Hypersil GOLDTMC18柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）。流動(dòng)相：A相為含 0.2%甲酸的水溶液，B為乙腈。流動(dòng)相梯度洗脫程序：0～1 min，10% B；1～3 min，10%～75% B；3～4 min，75%～100% B；4～10 min，100% B；10～11 min，100%～10% B；11～14 min，10% B。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：3 μL；分析時(shí)間：14 min。

質(zhì)譜條件：采用HESI離子化方式，正離子模式；噴霧電壓4 kV；毛細(xì)管溫度300℃；加熱器溫度 350℃；鞘氣（N2，>99%），35 mL·min-1；輔助氣體（N2，>99%），10 mL·min-1；掃描模式為 Full Scan，分辨率為 70 000 FWHM（m/z=200）；階梯標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量（NCEs）為 30、50、70 eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器參數(shù)的優(yōu)化

采用 500 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在全掃描（Full Scan）監(jiān)測模式（分辨率R=70 000）下，分析21種農(nóng)藥的分子離子峰[M+H]+精確質(zhì)量數(shù)，21種農(nóng)藥分子離子峰精確質(zhì)量數(shù)與質(zhì)量數(shù)偏差見表1。質(zhì)量數(shù)偏差窗口（Mass error window，MEW）是高分辨質(zhì)譜定量分析的關(guān)鍵參數(shù)，MEW過大，導(dǎo)致碎片離子質(zhì)量數(shù)偏差超出范圍，造成假陽性誤判或定量偏大；MEW過小，可能造成假陰性誤判或定量偏小。以嘧菌酯為例，在采用MEW 1×10-6、5×10-6、10×10-6條件下，1×10-6色譜峰形明顯變形，但5×10-6和10×10-6色譜峰形無明顯變化（圖1）。因此，本文選擇MEW為5×10-6。保留時(shí)間窗口（Retention time window, RTW）是影響UPLC-Orbitrap MS定量分析的另外一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。本文連續(xù)進(jìn)樣100 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品10針，21種農(nóng)藥的保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在5%范圍。因此，本文RTW為0.05 min。

2.2 吸附劑的優(yōu)化

為了考察不同吸附劑對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸附效果，分別稱取不同用量水平的吸附劑（SCX、PSA、C18和GCB用量分別為25、50、75、100 mg；MWCNTs用量分別為 5、12.5、25、37.5 mg），各加入 1 mL 50 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，C18、GCB、MWCNTs對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥吸附作用均隨用量的增加而增強(qiáng)，且 GCB和 MWCNTs的吸附作用最為明顯。GCB、C18、MWCNTs作為QuEChERS前處理技術(shù)中常用的分散固相吸附劑，可以有效去除基質(zhì)中的色素，對(duì)提取液顏色具有較強(qiáng)的凈化能力[12-13]。C18吸附劑疏水性較強(qiáng)，在有效去除脂肪酸和色素的同時(shí)，對(duì)非極性農(nóng)藥吸附作用也較強(qiáng)[14]。GCB對(duì)平面結(jié)構(gòu)物質(zhì)具有強(qiáng)烈的親和力，在凈化中對(duì)部分農(nóng)藥組分具有一定的保留[15-16]。此外，過量的使用吸附劑也會(huì)影響目標(biāo)農(nóng)藥的回收率[13,17]。由圖2所知，C18在4種用量水平下，氰草津、甲氧隆、磷胺和殘殺威的回收率在85%～100%，吸附并不明顯，但有9種目標(biāo)農(nóng)藥的回收率在其各個(gè)用量水平下均低于72%。經(jīng)25、50、75、100 mg不同用量的GCB吸附后，磷胺的回收率在63%～89%之間，其余20種農(nóng)藥的回收率均在72%以下；且當(dāng)用量超過50 mg時(shí)，除磷胺以外的 20種農(nóng)藥回收率均在33%以下。MWCNTs用量在5 mg時(shí)，二甲草胺、滅線磷、仲丁威、呋霜靈、甲霜靈、吡草胺、異丙甲草胺、磷胺、丙草胺和殘殺威的回收率可以達(dá)到76%以上；但當(dāng)MWCNTs用量在12.5 mg及以上時(shí)，21種目標(biāo)農(nóng)藥中僅磷胺的回收率在78%以上，其余農(nóng)藥的回收率均隨用量的上升大幅減少，最少降低至 0。而SCX和 PSA對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥的吸附作用并不明顯，回收率均在74%～113%之間；且隨吸附劑用量的增加，回收率變化不大。盡管C18、GCB和MWCNTs對(duì)茶葉基質(zhì)的凈化效果較好，但由于其對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥具有明顯的吸附作用，不適用于作為本方法的分散固相吸附劑。因而，選擇SCX和PSA對(duì)茶葉提取液的脫色效果進(jìn)行對(duì)比。

表1 21種農(nóng)藥的精確質(zhì)量數(shù)及其質(zhì)量數(shù)偏差Table1 Accurate masses and mass errors of 21 pesticides

分別稱取不同用量水平的SCX和PSA，加入l mL綠茶、紅茶提取液中，對(duì)比凈化液顏色的不同。結(jié)果顯示，SCX和PSA對(duì)茶葉基質(zhì)均具有明顯的脫色效果，且隨著 SCX、PSA用量（150、200、250 mg）的增加，提取液顏色逐漸變淡。當(dāng)用量為200 mg時(shí)，凈化液顏色與 250 mg用量下凈化效果差異不明顯。因此，SCX、PSA以200 mg·mL-1的用量為最佳。

基于對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥的吸附作用及對(duì)茶葉基質(zhì)的凈化效果，稱取SCX、PSA各200 mg，分別加入1 mL質(zhì)量濃度為50 μg·L-1的綠茶、紅茶基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液中，驗(yàn)證SCX-PSA混合吸附劑對(duì)茶葉基質(zhì)的凈化效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示，加入混合吸附劑凈化后，基質(zhì)顏色明顯變淡，呈透明顏色；除了氰草津在紅茶中的回收率為 72%，其余農(nóng)藥在綠茶、紅茶中的回收率均在82%～102%之間，符合農(nóng)殘檢測的要求。綜合回收率結(jié)果和對(duì)茶葉基質(zhì)的凈化效果，本文選擇各200 mg·mL-1的SCX和PSA混合吸附劑作為QuEChERS方法中的吸附劑材料。

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

本研究采用1.3節(jié)配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照1.4節(jié)的儀器條件檢測，以峰面積對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)，選擇空白的綠茶、紅茶樣品按1.3節(jié)配制的同樣濃度范圍的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以ME值定義基質(zhì)效應(yīng)，計(jì)算公式如下：

ME=[(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)－1]×100%。

圖1 嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液（20 μg·L-1）在不同質(zhì)量數(shù)偏差窗口（MEW）的提取離子流色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of azoxystrobin in standard solution at 20 μg·L-1 in different mass error windows (MEW)

圖2 21種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 μg·L-1）在不同吸附劑下的回收率Fig. 2 Recoveries of 21 pesticides in standard solution at 50 μg·L-1 with different absorbents

試驗(yàn)結(jié)果由表2所示，21種農(nóng)藥的 ME值為-27.0%～6.1%，基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)并不明顯，但在各個(gè)農(nóng)藥之間的基質(zhì)效應(yīng)差異較大。氯唑磷的基質(zhì)效應(yīng)為-27.0%～-14.4%，基質(zhì)抑制效應(yīng)表現(xiàn)最為明顯，其余農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)均在-18.4%～6.1%范圍內(nèi)?；诓煌N農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)的差異性，本文采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行定量。

綠茶（不發(fā)酵茶）和紅茶（發(fā)酵茶）之間的基質(zhì)效應(yīng)較為接近。21種農(nóng)藥在綠茶和紅茶中的 ME值分別為-27.0%～1.8%和-18.4%～6.1%。在綠茶中，14.3%的農(nóng)藥ME值在0%～10%以內(nèi)，81.0%的農(nóng)藥ME值在-20%～0%范圍內(nèi)，僅氯唑磷農(nóng)藥的基質(zhì)抑制效應(yīng)超過20%。在紅茶中，14.3%的農(nóng)藥 ME值在0%～10%以內(nèi)，其余農(nóng)藥ME值均在-20%～0%

范圍內(nèi)。由于21種農(nóng)藥在不同種類茶葉間的基質(zhì)效應(yīng)差異并不明顯，大批量茶葉樣品在篩選時(shí)可選擇一種茶類的空白茶葉基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行定量分析。

表2 21種農(nóng)藥在綠茶、紅茶中的基質(zhì)效應(yīng)、相關(guān)系數(shù)（r2）、線性范圍、檢出限（LOD）及定量限（LOQ）Table 2 Matrix effects, correlationcoefficients (r2), linear ranges, limits of detection (LODs) andlimits of quantitation (LOQs) of 21 pesticides in green and black teas

表3 綠茶和紅茶樣品中的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)Table 3 Recoveries andrelative standard deviations (RSDs) of 21 pesticides in spiked greenand blackteas %

圖3 提取離子流色譜圖及質(zhì)譜圖Fig. 3 Extracted ion chromatograms and mass spectra

2.3.2 線性范圍、檢出限、回收率和精密度

采用1.3節(jié)配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照 1.4節(jié)的儀器條件檢測，以相對(duì)峰面積（A目標(biāo)農(nóng)藥/A內(nèi)標(biāo)）對(duì)應(yīng)的相對(duì)質(zhì)量濃度（C目標(biāo)農(nóng)藥/C內(nèi)標(biāo)）作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)，選擇空白的綠茶、紅茶樣品按1.3節(jié)配制的同樣濃度范圍的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，同樣以相對(duì)峰面積（A目標(biāo)農(nóng)藥/A內(nèi)標(biāo)）對(duì)應(yīng)的相對(duì)質(zhì)量濃度（C目標(biāo)農(nóng)藥/C內(nèi)標(biāo)）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2所示，在綠茶和紅茶中，21種農(nóng)藥的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液在0.5～200 μg·L-1范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99。

在空白綠茶和紅茶樣品中添加 21種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)水平分別為10、50、100 μg·kg-1，按照 1.2和 1.4節(jié)中的方法對(duì)樣品進(jìn)行提取、凈化和檢測，回收率結(jié)果為目標(biāo)農(nóng)藥回收率與內(nèi)標(biāo)回收率比值?；厥章屎拖鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表3。在 10、50、100 μg·kg-13 個(gè)添加水平下，平均回收率在70%～125%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.1%～12.0%范圍內(nèi)。

由于高分辨質(zhì)譜的色譜圖中通常不存在背景噪音，則信噪比并不適用于定義本方法的檢出限和定量限[18]。因此，根據(jù)不同質(zhì)量濃度（0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg·L-1）下基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液響應(yīng)信號(hào)出現(xiàn)的最低質(zhì)量濃度，將其定為檢出限，則21種農(nóng)藥在茶葉中的檢出限為 0.5～2.5 μg·kg-1；根據(jù)歐盟委員會(huì)衛(wèi)生和食品安全總局（2015）的SANTE文件的指導(dǎo)原則，回收率在 60%～140%范圍內(nèi)，且 RSD<20%的最低加標(biāo)水平定為本方法的定量限[19-20]，21種農(nóng)藥的定量限定為 10 μg·kg-1。

2.4 方法應(yīng)用

采用本方法對(duì)浙江省市場上隨機(jī)抽取的綠茶、紅茶共40個(gè)樣品中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行篩查。檢測結(jié)果顯示，7份樣品中檢出三唑磷，其中5份樣品高于檢出限但低于定量限，另外2份樣品殘留量分別為 11.1 μg·kg-1和 71.4 μg·kg-1。其余農(nóng)藥在樣品中均為檢出。圖3為三唑磷紅茶基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液及三唑磷紅茶陽性樣品提取離子流色譜圖和質(zhì)譜圖。

3 結(jié)論

本文在優(yōu)化了QuEChERS方法的基礎(chǔ)上，以甲醇和水（V甲醇∶V水=1∶1）作為提取溶劑，結(jié)合UPLC-Orbitrap MS，建立了茶葉中21種農(nóng)藥殘留的快速篩選方法。高分辨質(zhì)譜的使用顯著減少了茶葉樣品中的基質(zhì)干擾，提高了定性定量分析的準(zhǔn)確性。本方法簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，可用作茶葉中多農(nóng)殘快速篩選及精確定量的檢測方法。