張麗之，樊 勝，安 娜，左希亞，高 彩，張 東，韓明玉

(西北農(nóng)林科技大學 園藝學院，陜西 楊凌 712100)

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)是苯丙烷類代謝的關鍵酶和限速酶，由一個多基因家族編碼，廣泛存在于各種植物和微生物中。它可以調(diào)控莖的伸長、種子的發(fā)育和果實的生長，還可以參與抗逆過程[1]。研究植物基因組中PAL基因家族成員的染色體定位和分布、基因與蛋白結構及表達特性對進一步研究其在植物生長發(fā)育過程中的功能具有重要意義。

1961年，PAL蛋白首次從綠色植物大麥(HordeumvulgareL.)中被分離鑒定[2]，此后相繼在擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、煙草(NicotianatabacumL.)、水稻(OryzasativaL.)、楊樹(PopulusL.)、番茄(LycopersiconesculentumMill.)、馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)、葡萄(VitisviniferaL.)和刺果松(Pinuslongaeva)等植物中被鑒定，但是不同植物中PAL基因家族成員的數(shù)量差異較大，馬鈴薯中基因拷貝數(shù)較多，擬南芥、煙草、水稻、楊樹和番茄中基因拷貝數(shù)較少[3-8]。PAL蛋白普遍存在一個由丙氨酸-絲氨酸-甘氨酸(Ala-Ser-Gly)組成的活性位點(MIO)，該位點是它們發(fā)揮功能的主要區(qū)域[8-10]。目前已經(jīng)完成了PAL基因在葡萄中的鑒定與分析，發(fā)現(xiàn)葡萄PAL基因可以聚為3類，其中VviPAL3、VviPAL4、VviPAL5、VviPAL6單獨聚為一類，可能是因為它們來源于被子植物分化前更為古老的祖先[8]。PAL基因家族在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著多種重要的生物學作用，可以調(diào)控莖、種子等的生長，AtPAL1、AtPAL2、AtPAL4在莖中表達量較高，AtPAL2和AtPAL4均能在種子中表達[1]。在甘蔗中研究發(fā)現(xiàn)，苯丙氨酸解氨酶PAL參與甘蔗細胞的防御反應，且在抗病品種中活性更高[11-12]。用短波紫外照射被灰霉病菌侵染的粉紅女士蘋果之后病斑的擴大被抑制，同時PAL活性明顯提高，可見，PAL在蘋果果實的抗逆過程中有著重要作用[13]。除此之外，PAL的轉(zhuǎn)錄活性與果實發(fā)育有密切聯(lián)系。葡萄中16個VviPAL基因在果實發(fā)育早期的表達均呈先升高后降低的趨勢，在果實發(fā)育最后階段表達模式多樣[8]。研究報道PAL的活性在蘋果的果實發(fā)育過程中有兩個高峰，一個為幼果期，一個為果實成熟期，蘋果未成熟果實中PAL活性最高，發(fā)育過程中降至低水平，成熟期間又升高[14-16]，草莓和梨中也有類似現(xiàn)象[14，17]。PAL基因家族參與形成植物果實內(nèi)HCA類酚類、類黃酮、木質(zhì)素等多種重要的次生代謝產(chǎn)物，它們影響果實的成熟、感官品質(zhì)和顏色等[8，18-22]。Lister等[23]對9個蘋果品種進行了研究，發(fā)現(xiàn)果實發(fā)育期間PAL的平均活性與最終的類黃酮總含量之間有顯著的相關關系(r=0.75，P<0.05)。

蘋果是世界四大水果(蘋果、葡萄、香蕉、柑橘)之一，是主要的經(jīng)濟作物，目前關于蘋果PAL基因家族的鑒定、特征和功能的系統(tǒng)性分析未見報道，已發(fā)表的蘋果全基因組序列為我們鑒定蘋果中PAL基因提供了線索[24]。利用已有的金冠基因組數(shù)據(jù)庫和一系列生物信息學手段，同時結合啟動子分析、實時熒光定量PCR等探究蘋果PAL基因家族成員的系統(tǒng)進化關系、基因結構、基因表達等，以期明確其在蘋果生長發(fā)育，包括不同組織和果實發(fā)育不同階段中可能發(fā)揮的功能，為深入研究蘋果苯丙氨酸解氨酶的功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和樣品采集

擬南芥中4個AtPAL的基因序列和蛋白序列根據(jù)文獻報道的基因登錄號在TAIR網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org)獲得[1]。初步比對之后獲得的蘋果中候選PAL基因登錄號在GDR蘋果全基因組數(shù)據(jù)庫blastp工具中(https://www.rosaceae.org/tools/ncbi_blast)獲得，其相應蛋白序列、基因序列、基因定位及基因注釋信息在金冠參考基因組數(shù)據(jù)庫中下載。用于構建多物種系統(tǒng)進化樹的擬南芥、葡萄、玉米、水稻等多個單子葉和雙子葉植物的PAL蛋白序列根據(jù)文獻報道的基因登錄號在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載[8]。金冠以及不同蘋果雜交種中不同器官的PAL基因表達數(shù)據(jù)(GSE42873)從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE42873)下載。

試驗于2017年在陜西省楊凌示范區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新園國家蘋果產(chǎn)業(yè)技術體系試驗示范果園(108°04′E，34°16′N)進行。供試材料為五年生長富2號/T337/八棱海棠。盛花期采集短枝頂花，盛花期后30 d另外采集幼果(直徑2 cm左右)、短枝頂芽毗鄰葉及短枝莖(直徑2～3 mm)[25]，用于研究組織特異性。為了探究蘋果PAL基因在果實發(fā)育過程中可能發(fā)揮的功能，試驗從盛花期后30 d開始，每隔30 d采集一次長富2號果實，共采集5次(盛花期后30、60、90、120、150 d)[26]。所有采集材料(莖，花，葉，盛花期后30 d的幼果包括果肉和果皮，不同發(fā)育時期的果實包括果肉和果皮)均用液氮冷凍，-80 ℃保存，用于RNA提取。

1.2 PAL基因家族成員的鑒定

將下載的擬南芥中4個AtPAL基因的蛋白序列作為查詢序列，在GDR蘋果全基因組利用blastp工具進行比對(https://www.rosaceae.org/tools/ncbi_blast)，在該數(shù)據(jù)庫中獲得估計值小于e-5的蘋果基因登錄號[27-28]，去除重復基因后，根據(jù)在金冠參考基因組數(shù)據(jù)庫中下載獲得的相應蛋白序列，利用NCBI blastp工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)去掉沒有PLN02457結構域(description: phenylalanine ammonia-lyase)的基因，獲得蘋果中的PAL。依據(jù)染色體位置排列對所獲得的蘋果PAL基因進行命名。利用在線網(wǎng)站ExPaSy(http://web.expasy.org/protparam/)預測MdPAL蛋白的理化性質(zhì)[29]。

1.3 MdPAL染色體定位、序列比對

基于從金冠蘋果基因組數(shù)據(jù)庫中下載獲得的基因定位和基因注釋信息，利用MapDraw軟件對MdPAL基因在染色體上的位置進行描繪[30]。利用軟件DNAMAN對MdPAL蛋白進行多重序列比對，依據(jù)比對結果鑒定MdPAL基因的旁系同源對[25，31-32]。旁系同源對基因必須滿足以下2個條件：(1)兩基因序列對齊之后，短基因序列與長基因序列的覆蓋率大于70%；(2)兩基因蛋白序列的一致性大于70%[33-34]。

1.4 MdPAL蛋白結構預測

利用在線網(wǎng)站SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)預測MdPAL蛋白的二級結構[35]。利用在線網(wǎng)站PHYRE serve v2.0(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2htmlpage.cgi？id=index)預測MdPAL蛋白的三級結構[36]。

1.5 系統(tǒng)進化分析、基因結構、保守蛋白分析和啟動子順式作用元件分析

用MEGA6.0軟件對蘋果8個MdPAL成員進行系統(tǒng)進化樹的構建，方法采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)，采取以下參數(shù)設置：校驗參數(shù)Bootstrap重復1 000次，模式為 p-diastance model，缺口設置為partial deletion[37]。利用MEGE6.0構建蘋果、擬南芥、葡萄、玉米、水稻等多個單子葉和雙子葉物種的系統(tǒng)進化樹來探究多物種PAL蛋白的進化關系，不同物種的蛋白序列通過文獻報道的基因登錄號在NCBI查詢獲得[8]，參數(shù)設置同上。利用The Gene Structure Display Serve 2.0(GSDS)(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線網(wǎng)站獲得MdPAL基因的外顯子-內(nèi)含子結構[38]。MdPAL的保守蛋白分析由在線網(wǎng)站MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)完成，除保守蛋白最大數(shù)量設置為10之外，其余參數(shù)采取默認參數(shù)[39]。利用金冠基因組數(shù)據(jù)庫獲得MdPAL起始密碼子上游1 500 bp作為啟動子序列，利用在線網(wǎng)站PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcarehtml)分析其啟動子的順式作用元件[25，31-32，40]。

1.6 基因表達分析

采用改良CTAB法[41]提取RNA，取完整性良好的總RNA經(jīng)RNase-Free DNase處理以去除基因組DNA，使用Clontech SMARTTM Libray試劑盒，按公司產(chǎn)品說明書操作合成cDNA。

使用實時熒光定量PCR對MdPAL基因的表達模式進行分析。利用Primer premier 5.0 軟件設計MdPAL特異性實時熒光定量引物(表1)，并引用文獻中的蘋果EF-1α(GenBank 登錄號DQ341381)作為內(nèi)參基因，其特異性引物為：EF-1α-F，5′-ATTCAAGTATGCCTGGGTGC-3′；EF-1α-R，5′-CAGTCAGCCTGTGATGTTCC-3′[42]。MdPAL3、MdPAL4、MdPAL6、MdPAL7四個基因的編碼序列極其相似，不能設計特異性定量引物將它們分離開來，因此共用一對定量引物[25，31-32]。

按照TaKaRa SYBR? Prime EXTaqTMⅡ試劑盒說明進行qRT-PCR反應，反應體系為10 μL∶5 μL SYBR? Prime EXTaqTMⅡ 2×，0.5 μL PCR正向引物(10 μmol·L-1)，0.5 μL PCR 反向引物(10 μmol·L-1)，1 μL DNA模板(<100 ng)，加去離子水補足10 μL。qRT-PCR反應在Bio-RAD IQ5熒光定量 PCR儀上完成。qRT-PCR程序為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性15 s；60 ℃退火20 s；72 ℃延伸20 s；40次循環(huán)。用2-ΔΔCt的方法計算基因的相對表達量[43]。每個樣本做3個平行樣，內(nèi)參和目的基因均做3次生物學重復。

利用在線數(shù)據(jù)庫GEO對MdPAL基因的組織特異性進行分析。從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE42873)下載金冠以及不同蘋果雜交種不同器官的基因表達數(shù)據(jù)(GSE42873)，并從中提取MdPAL相關基因的表達量[44]。

1.7 數(shù)據(jù)處理及圖表制作

試驗按完全隨機區(qū)組設計，每個處理設3個生物學重復，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用Excel 2010及SPSS 18.0分析軟件進行，使用Excel 2010進行相關圖表制作。

2 結果與分析

2.1 蘋果全基因組PAL基因家族成員的鑒定

利用生物信息學方法從蘋果全基因組中鑒定得到8個PAL基因家族成員(圖1)，依照它們在染色體上的位置信息，將它們依次命名為MdPAL1-MdPAL8。

利用EXPASY對MdPAL的基本信息和理化性質(zhì)進行了預測，包括序列長度、分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、平均親水性系數(shù)和脂肪指數(shù)，結果如表2和表3所示。8個MdPAL的蛋白長度在433～753個氨基酸(amino acid，aa)，其中，MdPAL2最短(433 aa)，MdPAL6最長(753 aa)。編碼區(qū)序列長度較長，均為1 500 bp以上。MdPAL編碼的分子量在47.713～81.748 ku，等電點在5.44～6.39，均略小于7，偏酸性，是酸性蛋白。所有MdPAL的不穩(wěn)定指數(shù)均小于40，都較穩(wěn)定。除去MdPAL2和MdPAL8，大多MdPAL蛋白均有很好的親水性，平均親水性系數(shù)均小于0。8個MdPAL蛋白中含量最豐富的氨基酸為亮氨酸和丙氨酸。

2.2 MdPAL染色體定位

根據(jù)鑒定得到的8個MdPAL的基因定位信息，利用MapDraw工具進行染色體定位作圖。由圖1可見，這8個基因分別定位在1號、3號、4號、8號、12號和17號染色體上，其中，1號、3號、8號和17號染色體上均僅存在1個MdPAL基因，4號和12號染色體上均存在2個MdPAL基因。除此之外，本試驗鑒定得到1對MdPAL旁系同源對(MdPAL3-MdPAL4)。

2.3 MdPAL蛋白結構分析

利用DNAMAN進行MdPAL多重蛋白序列比對，結果如圖2所示，所有MdPAL均包含圖中方框圈出的PAL蛋白家族普遍存在的由丙氨酸-絲氨酸-甘氨酸(Ala-Ser-Gly)組成的MIO保守結構域。

表1 MdPAL定量引物序列

表2 蘋果中PAL基因的基本信息

表3 MdPAL理化性質(zhì)

圖1 候選MdPAL基因染色體定位Fig.1 Chromosomal locations of MdPAL genes

圖2 候選MdPAL蛋白多重序列比對Fig.2 Conserved domain alignment of MdPAL proteins

利用在線網(wǎng)站SOPMA和PHYRE serve v2.0進行MdPAL二級結構和三級結構的預測，結果如表4和圖3所示，發(fā)現(xiàn)MdPAL蛋白的二級結構由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)卷曲組成，其中，α-螺旋和無規(guī)卷曲的占比較高，且所有MdPAL中均是α-螺旋的占比大于無規(guī)卷曲。

2.4 系統(tǒng)進化分析、基因結構及保守蛋白分析

為了探討不同物種PAL的進化關系，試驗收集了一個包括54條來自不同物種(其中8條來自蘋果，17條來自葡萄，7條來自玉米，9條來自水稻，4條來自擬南芥，4條來自煙草，5條來自白毛楊)的PAL蛋白序列的數(shù)據(jù)集，采用NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)蘋果MdPAL與葡萄、擬南芥、楊樹、煙草的PAL親緣關系比較近，與水稻、玉米親緣關系比較遠，可能是因為與單子葉植物相比，蘋果、葡萄等雙子葉植物分化時間更近。此外，對8個蘋果MdPAL蛋白構建系統(tǒng)進化樹的結果(圖5)表明，MdPAL3、MdPAL4、MdPAL6、MdPAL7進化關系比較近，聚為第一群(G1)；MdPAL1和MdPAL5聚為第二群(G2)；MdPAL2和MdPAL8聚為第三群(G3)。

利用GSDS在線網(wǎng)站進行MdPAL基因結構分析，圖5-a顯示進化關系較近的MdPAL具有相似的外顯子-內(nèi)含子結構，但也存在一些差異。G1擁有2個或3個外顯子，且它們第一個內(nèi)含子的位置較為保守。G3均有3個外顯子，G2中的兩個成員MdPAL1和MdPAL5分別有2個和3個外顯子。

利用MEME在線網(wǎng)站對蘋果8個MdPAL成員進行基序分析，將10個基序命名為motif1～motif10。圖5-b顯示G1中的成員都擁有motif1、motif2、motif3、motif4、motif6、motif7、motif8和motif9，motif5和motif10在MdPAL4中缺失；G2中的成員幾乎擁有全部10個motif，只motif8在MdPAL5中缺失；G3中的成員都擁有motif1、motif2、motif3、motif4和motif5。

表4 候選MdPAL蛋白二級結構

圖3 MdPAL三級結構的預測Fig.3 Tertiary structures of MdPAL proteins

蛋白序列由文獻報道的基因登錄號在NCBI查詢獲得[8]。The protein sequence was obtained from the NCBI query by the gene landing number reported in the literature[8].圖4 多個物種中PAL蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic analysis of PAL proteins of different varieties

a，MdPAL無根進化樹及外顯子-內(nèi)含子分析；b，保守蛋白分析，其中1，motif1；2，motif2；3，motif3；4，motif4；5，motif5；6，motif6；7，motif7；8，motif8；9，motif9；10，motif10；c，motif序列。a，An un-rooted phylogenetic tree of MdPAL proteins and exon-intron analysis; b，Conserved motifs analysis，In picture b: 1，motif1; 2，motif2; 3，motif3; 4，motif4; 5，motif5; 6，motif6; 7，motif7; 8，motif8; 9，motif9; 10，motif10; c，Conserved motifs sequence.圖5 MdPAL基因結構與保守蛋白Fig.5 Gene structure and conserve motifs analysis of MdPAL

2.5 啟動子順式作用元件

為了探究PAL在蘋果中的表達調(diào)控機制，利用在線網(wǎng)站PLANTCARE分析了其啟動子區(qū)域的順式作用元件，結果如圖6所示，發(fā)現(xiàn)蘋果中8個MdPAL都擁有響應逆境脅迫的順式作用元件；植物激素茉莉酸甲酯響應元件(methyl jasmonate，MEJA)、水楊酸響應元件(salicylic)、赤霉素響應元件(gibberellin)、植物生長素響應元件(auxin)、乙烯響應元件(ethylene)等在8個候選MdPAL中也有發(fā)現(xiàn)；光周期(circadian)作用元件除MdPAL3和MdPAL4外，在其他成員中均有發(fā)現(xiàn)。

1，茉莉酸甲酯誘導；2，水楊酸誘導；3，赤霉素誘導；4，生長素誘導；5，乙烯響應；6，脅迫誘導；7，晝夜節(jié)律調(diào)控。1，MeJA-responsiveness; 2，Salicylic acid responsiveness; 3，Gibberellin-responsiveness; 4，Auxin-responsiveness; 5，Ethylene-responsiveness; 6，Stress responsiveness; 7，Circadian control.圖6 啟動子順式作用元件Fig.6 Predicted cis-elements in promoter of MdPAL genes

2.6 MdPAL在不同組織中的表達分析

試驗采用在線網(wǎng)站GEO分析和實時熒光定量PCR兩種方法探討MdPAL在不同組織器官中的表達模式。從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE42873)中下載金冠以及不同蘋果雜交種不同器官的基因表達數(shù)據(jù)，提取MdPAL基因表達量。利用Heatmap軟件制作熱圖(圖7)可以發(fā)現(xiàn)，MdPAL1、MdPAL5、MdPAL2、MdPAL8除在金冠和一些蘋果雜交種的種子、幼苗、根莖中表達量較低以外，在別的品種器官中表達均較高；MdPAL3、MdPAL4、MdPAL6、MdPAL7在M14和M49的葉片中表達量很高；所有的成員在金冠及不同蘋果雜交種的種子中幾乎沒有表達。這些結果為進一步研究MdPAL基因的功能提供了借鑒。

為了進一步探明MdPAL基因在蘋果生長發(fā)育的過程中可能發(fā)揮的作用，采集蘋果主栽品種長富2號/T337/八棱海棠的不同組織器官(莖、花、果、葉)，研究它們在不同組織器官中的表達模式。由于MdPAL基因結構高度保守，因此8個基因共設計出5對引物，如表1所示[32-34]。利用SYBR Green試劑盒進行蘋果中MdPAL的組織特異性分析，結果如圖8所示，發(fā)現(xiàn)進化關系更近的MdPAL1和MdPAL5在4個組織中均有表達，但在花和葉的表達量顯著高于莖和果中的表達量；進化樹中聚為一類的MdPAL2和MdPAL8在4個不同組織中的表達情況基本一致，均在葉中的轉(zhuǎn)錄水平更高，在其他3個組織器官中僅微量表達；MdPAL3、MdPAL4、MdPAL6、MdPAL7在葉中的表達量顯著高于其余3個組織器官，在莖和果中的表達量也較高。

2.7 MdPAL在不同果實發(fā)育期的表達

試驗進行了MdPAL在果實發(fā)育5個時期的表達分析，結果發(fā)現(xiàn)MdPAL1在果實發(fā)育5個時期中都沒有表達量，其余MdPAL在果實發(fā)育的5個時期均有表達(圖9)，說明MdPAL在果實發(fā)育過程中可能發(fā)揮著重要的作用。隨著果實發(fā)育，MdPAL2、MdPAL5、MdPAL8的轉(zhuǎn)錄水平先降低后升高，MdPAL2在盛花期后30和150 d轉(zhuǎn)錄活性較高，MdPAL5在盛花期后120和150 d表達量較高，MdPAL8在盛花期后120和150 d表達量較高，且顯著高于其余3個時期。MdPAL3/4/6/7的轉(zhuǎn)錄水平隨著果實發(fā)育逐漸降低，在盛花期后30 d的表達量顯著高于其余4個時期，可推測其活性高峰出現(xiàn)在幼果發(fā)育期?？傊?，MdPAL的活性高峰出現(xiàn)在果實發(fā)育前期(盛花期后30 d)或果實成熟期(盛花期后120、150 d)，可能在果實的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

3 討論

PAL是苯丙烷代謝的關鍵酶和限速酶，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。本試驗對蘋果中的PAL基因進行鑒定，并且進一步探討了MdPAL蛋白的理化性質(zhì)、基因結構、系統(tǒng)進化關系及其在不同組織器官和不同發(fā)育時期的表達模式。

GD，金冠; M69、M74、M20、X8877、M14、M49、X4102、X4442x2596和X3069x992為不同蘋果雜交種。GD，Golden Delicious; M6，M74，M20，X8877，M14，M49，X4102，X4442 and X3069 were various apple hybrids.圖7 MdPAL在不同蘋果品種的不同組織中的表達模式Fig.7 Expression profiles of MdPAL genes in different tissues and different apple varieties

不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same lowercase letters showed significant difference at P<0.05.The same as below.圖8 MdPAL在長富2號不同組織器官中的表達模式Fig.8 Expression patterns of MdPAL genes in different tissues in Nagafu No.2

圖9 MdPAL基因在長富2號不同時期果實中的表達模式Fig.9 Expression patterns of MdPAL genes in different periods of fruit of Nagafu No.2

本文在蘋果中共鑒定出8個MdPAL基因，比白毛楊、水稻、擬南芥中多，這可能與蘋果基因組較大和全基因組復制有關[24]。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，MdPAL結構高度保守，MdPAL成員都含有一個由Ala-Ser-Gly組成的高度保守的亞甲基咪唑酮(MIO)親電基團[8]。本試驗對MdPAL蛋白特性進行了分析，包括序列長度、分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、平均親水性系數(shù)和脂肪指數(shù)，發(fā)現(xiàn)8個MdPAL蛋白均具有較好的親水性和穩(wěn)定性，并且均略顯酸性。系統(tǒng)進化樹分析表明，大多數(shù)MdPAL與煙草、白毛楊等雙子葉植物的PAL蛋白親緣關系更近，可能來源于同一祖先。大多植物中，PAL基因可以分為2～3個不同的類群或亞群[10]，蘋果中8個MdPAL蛋白進行系統(tǒng)進化樹構建，發(fā)現(xiàn)也聚為3類，系統(tǒng)進化樹聚為同一類的MdPAL基因結構較為保守，外顯子和內(nèi)含子的數(shù)量基本一致，motif也基本一致。另外蘋果中所有MdPAL成員都擁有響應逆境脅迫的順式作用元件，這一點與前人研究的PAL基因家族參與抗逆過程一致[1，11-13]

本文通過GEO數(shù)據(jù)庫和實時熒光定量PCR兩種方法分析了蘋果PAL基因家族成員在不同組織中的表達模式。通過GEO數(shù)據(jù)庫我們發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)進化樹中聚為一類的MdPAL表達模式相似，但也存在細微差異。采用實時熒光定量PCR方法對MdPAL的組織特異性進行探究，發(fā)現(xiàn)MdPAL3/4/6/7在莖中有較高的表達水平，可能是因為與它們親緣關系較近的AtPAL1和AtPAL2具有調(diào)控莖伸長的功能[1]。MdPAL1和MdPAL5除了在葉中表達量較高以外，在花中也有較高的表達量，推測它們可能在花的生長發(fā)育過程中也發(fā)揮重要作用，這與GEO數(shù)據(jù)庫得出的結果一致，但仍需進一步驗證。MdPAL3/4/6/7在葉中的表達量最高，推測它們發(fā)揮功能的部位可能主要在葉，這一點也與GEO數(shù)據(jù)庫得出的結果一致。G3中的MdPAL2和MdPAL8的組織特異性相似，在葉中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他3個組織部位，可推測二者發(fā)揮功能的主要部位可能是葉。

為了進一步探究MdPAL在果實發(fā)育不同時期可能發(fā)揮的功能，本文在果實發(fā)育的5個時期對MdPAL的表達模式進行了分析。MdPAL1在果實發(fā)育的5個時期都沒有表達量，推測其在果實生長發(fā)育過程中不發(fā)揮功能，但有待進一步驗證。隨著果實發(fā)育，MdPAL2、MdPAL5、MdPAL8轉(zhuǎn)錄活性均是先降低后升高，與前人研究一致[14-16]。除了MdPAL1以外，其余MdPAL在不同時期的果實中均有較高的表達水平，其中，MdPAL2的活性高峰出現(xiàn)在果實發(fā)育前期和果實成熟期，MdPAL5和MdPAL8的轉(zhuǎn)錄水平高峰出現(xiàn)在果實成熟期，MdPAL3/4/6/7的活性高峰出現(xiàn)在幼果發(fā)育期，說明MdPAL可能在果實的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，這與前人研究相符[14-16]。PAL參與形成植物體內(nèi)類黃酮等次生代謝物質(zhì)，并且其活性與類黃酮含量顯著相關[10，18，20，23]，由此推測蘋果中PAL基因家族成員可能是通過影響果實中類黃酮等物質(zhì)的含量來調(diào)控其生長發(fā)育和成熟過程的。本試驗為進一步研究MdPAL基因在調(diào)控蘋果生長發(fā)育，包括不同組織器官和果實發(fā)育不同階段中可能發(fā)揮的功能奠定了基礎。