趙 亮，陳 月，方應國，饒桂維

(浙江樹人大學 生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州 310015)

我國的花生年產量約為1 450萬t以上，產生的花生殼約450萬t，其中大部分被當成廢渣丟棄或燃料使用，利用率極低[1]?；ㄉ鷼ぜs占花生質量的30%，其中主要含半纖維和粗纖維，兩者約占花生殼質量的75%～80%，另有粗蛋白、粗脂肪、糖類與礦物質等成分[2]。此外，花生殼還含有一些功能成分，如黃酮類化合物、白藜蘆醇、胡蘿卜素、木糖、皂草甘等[3]?；ㄉ鷼ぷ鳛橐环N價廉、可再生的資源，是提取食物天然抗氧化劑和防腐劑的理想材料，具有廣闊的應用前景[4]。

近年來，為提高花生殼的利用價值，科研人員對花生殼進行了大量的研究，如用于農用肥料、飼料、食品、復合材料、活性炭等多個領域[5]。薛偉等[6]以花生殼為原料制備一種無定形碳材料碳基固體酸，具有成本低、原料可再生和環(huán)境友好等優(yōu)點。張再利等[7]以花生殼為生物吸附劑，研究其吸附Pb2+、Cu2+、Cr3+、Cd2+、Ni2+的動力學和熱力學，結果表明，花生殼對5種金屬離子的吸附具有自發(fā)、吸熱和熵增的特性。目前，市場上銷售的花生的產地來源較多，質量參差不齊，難以保證相應的產品質量，通過調查發(fā)現，新昌小京生是全國稀有的炒食花生優(yōu)質品種，其色、香、味俱佳，經濟價值較高[8]，但有關其成分分析的研究鮮見報道。近年來，HPLC指紋圖譜作為一種研究復雜物質體系的技術手段，被廣泛用于質量控制等方面，具有快速準確等特點[9]。指紋圖譜技術源于指紋鑒定學，中藥指紋圖譜通常是指能表達中藥有關化學成分的特征譜圖[10]，按照測定手段可分為化學指紋圖譜和生物指紋圖譜兩大類[11-13]。通常得到的指紋圖譜相當復雜，人工比較難免影響結果的準確性，若將其與計算機圖譜解析和識別技術結合起來，其應用前景將大為擴展[14-15]。雖有相關報道對花生殼成分進行了初步探索[16-17]，但未利用HPLC指紋圖譜對共有化學特征峰等進行統(tǒng)計學分析，信息也十分有限。本實驗采用HPLC法對8個產地不同品種的花生殼進行指紋圖譜研究及模式識別，以期為花生殼及其相關產品的質量控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選用8個花生品種作為研究材料，其產地及品種信息見表1。

Agilent 1100系列液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器(Agilent公司，美國)；Milli-Q超低有機物型純水系統(tǒng)(Millipore公司，美國)；高速離心機LG10-2.4A(北京時代北利離心機有限公司)；紫外分光光度計L6S(上海儀電分析儀器有限公司)；電子天平PL402-L(梅特勒-托利多儀器有限公司)；JK-100型超聲波清洗器(合肥金尼機械制造有限公司)；C型30玻璃儀器快速烘干器(長城科工貿有限公司)；GM-0.33A隔膜真空泵(天津市津騰實驗設備有限公司)乙腈為色譜純，甲醇、磷酸和其他試劑為分析純，實驗用水為超純水。所用溶液使用前均用0.22 μm濾膜過濾。

1.2 提取工藝

分別稱取8種花生殼各5.0 g，置于100 mL錐形瓶中，用量筒量取100.0 mL的甲醇加入錐形瓶，用保鮮膜封住瓶口，浸泡12 h后，將錐形瓶放入超聲波清洗器中超聲30 min，然后在4 000 r·min-1的條件下離心10 min，取上清液即得。

1.3 色譜條件

WondaCract ODS-2 C18(5 μm×4.6 mm×150 mm)色譜柱。流動相為0.5%磷酸溶液(A)和乙腈(B)；洗脫程序：0～10 min，80%～70% A；10～20 min，70%～60% A；20～35 min，60%～30% A；35～45 min，30%～20% A；45～55 min，20%～30% A；流速1 mL·min-1；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。

1.4 實驗條件的選擇

1.4.1 提取溶劑的選擇

稱取S6花生殼5.0 g，取3份，各置于100 mL錐形瓶中，分別加入相同體積的甲醇、乙醇、乙腈，浸泡12 h后，超聲30 min，在4 000 r·min-1的條件下離心10 min，取上清液過濾，在1.3節(jié)的的色譜條件下分別進樣分析，確定提取溶劑的類型。上述不同溶劑提取實驗進行3次平行實驗，數據取平均值。

表1 供試花生的產地及品種

1.4.2 色譜分析波長及流動相的選擇

根據1.2節(jié)中的方法分別制備8種花生殼的供試樣品溶液，將樣品溶液分別置于比色皿中，利用紫外可見分光光度計采集樣本光譜，掃描波長范圍為200～600 nm。每個樣品采集1次，掃描次數1次。上述8種花生殼提取實驗進行3次平行實驗，數據取平均值。

為了確定好的分離條件，分別考查甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.5%磷酸、甲醇-0.5%磷酸溶液的流動相對色譜分析結果的影響，從而最終確定實驗的流動相。

1.5 方法學考查

1.5.1 精密度實驗

取S6樣品供試液，連續(xù)進樣6次，以峰值最高的3個峰為參照峰，計算各共有峰相對峰面積的相對標準偏差(RSD)，以考查實驗方法的精密度。

1.5.2 穩(wěn)定性實驗

取S6樣品供試液，在1.3節(jié)色譜條件下分別在0、2、4、6、8 h下進行含量測定，記錄峰面積并計算峰面積測定結果的RSD，以考查實驗方法的穩(wěn)定性能。

1.5.3 重復性實驗

取S6樣品供試液，按供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，在1.3節(jié)色譜條件下測定，記錄峰面積并計算測定結果的RSD，以考查實驗方法的重復性能。

1.6 指紋圖譜的數據處理

1.6.1 相似度分析

分別將8種花生殼樣品的色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004年A版)軟件里，以生成的特征指紋圖譜共有模式為對照，計算各樣品的相似度，考查色譜峰的一致性。

1.6.2 系統(tǒng)聚類分析

系統(tǒng)聚類分析能夠揭示樣品間的關系，繼而對樣品進行分類，能提供的圖譜信息較多，可作為中藥指紋圖譜應用于質量控制的補充，這將在中藥材質量控制及綜合評價分析中發(fā)揮作用。本實驗采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，以相對峰面積為變量，對8個產地不同品種的花生殼做聚類譜系圖，進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 實驗條件的確定

2.1.1 提取溶劑

在乙醇、甲醇、乙腈3個溶劑的色譜分析結果中，以甲醇提取的色譜峰數目最多，效果較好，所以實驗采用甲醇為提取溶劑。

2.1.2 色譜流動相確定

在以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.5%磷酸、甲醇-0.5%磷酸溶液為流動相的色譜分析比較實驗中，發(fā)現乙腈-0.5%磷酸溶液作為流動相時，各峰分離效果較好，色譜峰形較好，經多次實驗得出較為理想的梯度洗脫條件，故選擇乙腈-0.5%磷酸溶液作為實驗的流動相。

2.1.3 色譜分析的波長

本實驗用紫外分光光度計采集樣本光譜，見圖1。由圖1可知，8種樣品溶液在200～404 nm有較強的吸收，在230和290 nm處吸收峰較高，但由于230 nm處波長較短，溶劑效應較強。預實驗發(fā)現，波長為290 nm時色譜峰的數目最多，所以實驗采用的色譜分析波長為290 nm。

2.2 花生殼指紋圖譜的建立

對8種花生殼進行記錄，測定色譜圖，并利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A對8種花生殼樣品的圖譜數據進行分析，設置S2為參照指紋圖譜，采用多點校正后進行匹配，建立8種花生殼的HPLC共有模式圖，結果見圖2和圖3。由圖2可見，8種花生殼指紋圖譜共有14個共有峰。8種花生殼的供試品圖譜與對照指紋圖譜相似度依次為0.761、0.940、0.909、0.987、0.989、0.992、0.989、0.931，說明8個品種的花生殼總體上相似度較高，只有新昌小京生花生殼(S1)相似度稍低。

2.3 系統(tǒng)聚類分析

以8種花生殼指紋圖譜的14個共有峰的相對峰面積(表2)為變量，用SPSS 20.0數據系統(tǒng)分析軟件對其進行系統(tǒng)聚類分析，選用組間聯接聚類方法，采用歐式距離度量標準，計算樣品的相似性程度，聚類結果見圖4。結果表明，8種花生殼可分為兩大類：紹興新昌小京生、嵊州小紅毛、云南七彩、江蘇大白鯊花生殼(S1、S2、S3、S8)為一類，江蘇魯花十一號、山東黑玉珍、山東平度富硒黑皮、山東改良?；ㄒ惶柣ㄉ鷼?S4、S5、S6、S7)為另一類。前一類在地域上并無明顯一致性，但這類花生大多較為瘦小，殼薄質輕，另一類除魯花十一號以外均產自山東，并且這類花生較為粗大，果實飽滿。

圖1 樣品紫外光譜掃描圖Fig.1 UV spectrogram of sample

圖2 八種樣品HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of 8 samples

圖3 花生殼對照指紋圖Fig.3 Peanut shell contrast fingerprints

表2 共有峰的相對峰面積

1～14號峰的保留時間依次為1.5，2.4，4.5，5.2，5.5，6.1，6.9，9.6，13.4，14.5，19.9，25.5，26.0，36.6 min。

The retention time of Peak 1-14 were 1.5，2.4，4.5，5.2，5.5，6.1，6.9，9.6，13.4，14.5，19.9，25.5，26.0，36.6 min, respectively.

圖4 8種花生殼的聚類樹Fig.4 Cluster tree of 8 kinds of peanut shells

2.4 方法學評價

2.4.1 精密度

在實驗條件下按精密度實驗評價方法測定樣品S6的色譜峰，以峰值最高的3個峰為參照峰，結果見表3。結果表明，該方法具有良好的精密度與準確度。

2.4.2 穩(wěn)定性

取S6樣品供試液，在1.3節(jié)色譜條件下分別在0、2、4、6、8 h下進行含量測定，記錄相對峰面積，結果見表4。結果表明，該方法具有良好的穩(wěn)定性。

2.4.3 重復性

取S6樣品供試液，按供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，在1.3節(jié)色譜條件下測定，記錄相對峰面積，結果見表5。結果表明，該方法具有良好的重復性。

表3 精密度實驗結果

表4 穩(wěn)定性實驗結果

表5 重復性實驗結果

3 結論

本實驗通過HPLC得出8個產地不同品種的花生殼的色譜圖，建立了測定的色譜條件，并且對8種花生殼進行指紋圖譜研究，用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)進行評價，通過相似度、系統(tǒng)聚類分析方法，對不同品種進行鑒別研究。結果表明，8個品種主要分為2大類：紹興新昌小京生、嵊州小紅毛、云南七彩、江蘇大白鯊花生殼為一類；江蘇魯花十一號、山東黑玉珍、山東平度富硒黑皮、山東改良?；ㄒ惶柣ㄉ鷼榱硪活?。該HPLC指紋圖譜檢測方法簡便快捷，重現性好，可用于花生的質量控制，能夠實現對不同品種花生的初步鑒定。