孫超塵，燕 飛，陳劍平，*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.浙江省植物有害生物防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植保生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省植保生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310021)

熱休克蛋白40(heat shock protein 40，HSP40)廣泛存在于生物界，是一類進(jìn)化上高度保守的蛋白。其家族含有保守的J結(jié)構(gòu)域，因此又被稱為DnaJ蛋白，其同源蛋白被稱為DnaJ-like蛋白。DnaJ-like蛋白發(fā)揮二硫化物異構(gòu)酶作用催化蛋白二硫化和異構(gòu)化[1]，亦可作為分子伴侶協(xié)助HSP70發(fā)揮作用[2]，參與生物體蛋白折疊、裝配、運(yùn)輸、降解、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、mRNA剪接等多種生理過程。如大豆中的DnaJ-like蛋白可調(diào)控細(xì)胞死亡與抵抗疾病[3]；擬南芥中的DnaJ-like蛋白可調(diào)控向光素介導(dǎo)的葉綠體運(yùn)動(dòng)以參與光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，還可與細(xì)胞骨架相互作用調(diào)節(jié)重力信號傳輸[4]；在哺乳動(dòng)物及人體中，DnaJ蛋白可以促進(jìn)卵巢生成雌性激素[5]，并作為腫瘤診斷指標(biāo)[6-7]。DnaJ-like蛋白對于抵抗高溫、干旱、鹽脅迫及缺氧等逆境脅迫也具有重要意義[8-9]。

DnaJ蛋白具有約70個(gè)氨基酸組成的保守J結(jié)構(gòu)域，核心結(jié)構(gòu)為組氨酸/脯氨酸/天冬氨酸(His/Pro/Asp，HPD)三肽，根據(jù)結(jié)構(gòu)差異分為3種類型[10]。A類亞家族蛋白包含4種結(jié)構(gòu)域：N端的DnaJ 結(jié)構(gòu)域，富含甘氨酸和苯丙氨酸結(jié)構(gòu)域(G/F結(jié)構(gòu)域)，含有4個(gè)Cys-X-X-Cys-X-Gly-X-Gly基序的富含半胱氨酸(CRR)結(jié)構(gòu)域(G/F與CRR結(jié)構(gòu)域亦被視為類鋅指基序)和不保守的C末端結(jié)構(gòu)域(CTD)；B類亞家族蛋白包含除CRR結(jié)構(gòu)的3種結(jié)構(gòu)域；C類亞家族蛋白具備DnaJ結(jié)構(gòu)域與CTD結(jié)構(gòu)域，可能包含細(xì)胞器定位序列、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列、法尼基化信號等不同結(jié)構(gòu)域。

研究表明，DnaJ-like蛋白響應(yīng)多種病毒的侵染，但發(fā)揮的作用各不相同。在臨床醫(yī)學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)DnaJ家族蛋白Hdj1和hTid1與乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)相互作用并可能抑制病毒復(fù)制[11]；而DnaJ家族蛋白Hdj2直接與日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)的NS5相關(guān)并促進(jìn)病毒復(fù)制[12]。植物中，DnaJ蛋白突變抑制了雀麥花葉病毒(Brome mosaic virus，BMV)的負(fù)義鏈RNA合成[13]。煙草cDNA文庫中鑒定出一類DnaJ家族蛋白NtMPIP1，與煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的運(yùn)動(dòng)蛋白互作，沉默該基因抑制了病毒的傳播[14]。用酵母雙雜交對水稻cDNA文庫進(jìn)行篩選，得到與水稻條紋病毒(Rice stripe virus，RSV)的運(yùn)動(dòng)蛋白PC4互作的DnaJ類蛋白[15]。在番茄、擬南芥和普通煙草中發(fā)現(xiàn)了與番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)運(yùn)動(dòng)蛋白互作的DnaJ蛋白，推測其可能參與病毒運(yùn)動(dòng)[16]。馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PYV)的外殼蛋白招募寄主DnaJ蛋白協(xié)助病毒侵染，在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)與TSWV互作的DnaJ蛋白并不能與PVY互作，反之亦然[17]。在本氏煙中鑒定得到一個(gè)DnaJ蛋白，該蛋白可以與馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)的外殼蛋白相互作用，過表達(dá)或缺失該蛋白基因都抑制了病毒的運(yùn)動(dòng)和復(fù)制[18]。

蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)在分類上屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)，其寄主范圍廣泛，危害程度嚴(yán)重，給全球蔬菜生產(chǎn)造成了極大經(jīng)濟(jì)損失[19-20]。TuMV主要由蚜蟲傳播，在不同寄主植物上產(chǎn)生花葉、壞死和矮化等不同類型癥狀，不同的病毒株系造成病毒癥狀也不同[21]。其病毒粒子呈彎曲線形，大小為(700～800) nm×(15～20) nm，螺旋對稱[22]。全基因組為一條正義鏈單鏈RNA[23]，長為9 798～9 844個(gè)核苷酸，編碼一個(gè)大的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，兩端各有一個(gè)非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)，通過多聚蛋白策略和核糖體移碼策略編碼等表達(dá)11個(gè)結(jié)構(gòu)和功能不同的成熟蛋白[24]，從5′端起依次為P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb-Pro和CP蛋白。

目前，關(guān)于DnaJ-like蛋白是否響應(yīng)TuMV侵染，是否在TuMV侵染過程中執(zhí)行某種作用尚不清楚。本研究對此開展工作，期望能夠明確該家族蛋白在TuMV侵染過程中的作用，為深入了解病毒致病和植物抗病毒機(jī)制提供理論數(shù)據(jù)，也為開辟綠色安全的防治手段提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

野生型本氏煙(Nicotianabenthamiana)種子為實(shí)驗(yàn)室保存，種植土壤條件為蛭石、營養(yǎng)土體積比為1∶1，25 ℃恒溫培養(yǎng)，光周期16 h/8 h (L/D)，水分適中。

大腸埃希菌菌株Trans5α/T1、pEASY-Blunt Zero克隆載體購自全式金生物有限公司，其他供試菌株及載體為本實(shí)驗(yàn)室保存。煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)侵染性克隆載體(pYL192)由清華大學(xué)劉玉樂教授提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取和本氏煙DnaJ基因克隆

采用Trizol法提取本氏煙總RNA，經(jīng)三氯甲烷抽提、異丙醇沉淀、75%乙醇清洗等過程，得到RNA，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將所得本氏煙RNA按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，利用Primer 3 plus在線工具設(shè)計(jì)引物，引物見表1，采用KOD高保真酶(TOYOBO)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增得到目的片段。

按照pEASY-Blunt Zero克隆載體說明書將PCR產(chǎn)物與載體連接，42 ℃熱激90 s轉(zhuǎn)化大腸埃希菌菌株Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR檢測為陽性的菌液送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序，鑒定陽性單克隆并抽提質(zhì)粒，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 初步生物信息學(xué)分析

將獲得的基因序列在NCBI和SOL GENOMIC數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對，使用DNAMAN、ClusalIX、MEGA等軟件工具分析所得序列同源性。

1.2.3 本氏煙系統(tǒng)沉默基因

利用TRV介導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)技術(shù)在本氏煙中沉默目的基因。

以1.2.1節(jié)所得陽性克隆質(zhì)粒為模板，利用SOL GENOMIC數(shù)據(jù)庫工具選定VIGS區(qū)段，設(shè)計(jì)引物，采用不依賴連接反應(yīng)的克隆法(ligation-independent cloning，LIC)構(gòu)建TRV沉默載體，檢測鑒定陽性單克隆并抽提質(zhì)粒凍存。將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌EHA105，注射本氏煙，沉默植株內(nèi)源基因。觀察植物沉默表型，檢驗(yàn)TRV載體，并參照Vazyme公司說明書利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)檢測目的基因表達(dá)水平，所用引物見表2。

1.2.4 分子生物學(xué)技術(shù)檢測病毒含量

在本氏煙上注射TuMV-GFP侵染性克隆，發(fā)病后取植物總RNA并檢驗(yàn)病毒，用qPCR檢測植物DnaJ家族基因的表達(dá)量變化，相關(guān)引物如表3所示。

表2 VIGS載體構(gòu)建相關(guān)引物序列

在本氏煙沉默目的基因后，接種TuMV，持續(xù)監(jiān)測植株變化。分別于3.5、6.0 d對實(shí)驗(yàn)組和對照組植株接種葉和系統(tǒng)葉拍照取樣，并取樣品參照《分子克隆》所述方法做Western blot檢測，在蛋白水平檢測病毒含量變化。

表3 TuMV和DnaJ-like基因檢測引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 本氏煙DnaJ基因克隆

根據(jù)參考文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫對DnaJ基因的報(bào)道設(shè)計(jì)引物，在本氏煙中克隆得到16條DnaJ基因，命名為NbJ1～NbJ14，其中NbJ12和NbJ14各有2條序列，ORF僅有個(gè)別氨基酸差異，將它們的第二條序列命名為NbJ12-2和NbJ14-2。在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找基因序列的ORF，翻譯為蛋白質(zhì)，利用DNAMAN和ClusalIX進(jìn)行多序列比對，在MEGA5中采用臨接算法(neighbor-joining，NJ)將這些蛋白序列構(gòu)建為進(jìn)化樹。這些蛋白都具有保守的J結(jié)構(gòu)域和G/F結(jié)構(gòu)域，彼此之間有較高相似性，聚類分析顯示，NbJ3～NbJ6蛋白序列屬于DnaJ蛋白的A類亞家族，其他NbJ蛋白序列屬于B類亞家族(圖1-A)。挑選2類亞家族的典型蛋白NbJ5和NbJ1，分別與NCBI數(shù)據(jù)庫中不同物種的該家族蛋白做同源性分析。結(jié)果顯示：DnaJ蛋白A類亞家族的NbJ5與立枯絲核菌等真菌和光滑爪蟾等動(dòng)物中的DnaJ蛋白具有較高同源性，與草莓、棉花等植物來源的DnaJ蛋白同源性低于上述序列；B類亞家族中的NbJ1則與普通煙、棉花、山萮菜等植物的DnaJ蛋白同源性較高，與真菌、動(dòng)物等來源的DnaJ蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；NbJ5和NbJ1與細(xì)菌來源的DnaJ蛋白在分析中均顯示了較低同源性(圖1-B與圖1-C)。

A，NbJ1～NbJ14，NbJ12-2和NbJ14-2系統(tǒng)進(jìn)化分析；B，NbJ5與其他生物中DnaJ-A家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析；C，NbJ1與其他生物中DnaJ-B家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析；D，NbJ1和NbJ5與已報(bào)道的病毒侵染相關(guān)DnaJ蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析。A，Phylogenetic analysis of NbJ1-NbJ14，NbJ12-2 and NbJ14-2; B，Phylogenetic analysis of NbJ5 and DnaJ-A family proteins from other organisms; C，Phylogenetic analysis of NbJ1 and DnaJ-B family proteins from other organisms; D，Phylogenetic analysis of NbJ1，NbJ5 and the reported virus infection-related DnaJ proteins圖1 基于蛋白序列的本氏煙DnaJ-like系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic relationships of N.benthamiana DnaJ-like proteins based on sequence alignments of the proteins

在NCBI中對NbJ1～NbJ14、NbJ12-2和NbJ14-2進(jìn)行氨基酸比對，發(fā)現(xiàn)DnaJ蛋白A類亞家族的NbJ5與數(shù)據(jù)庫顯示的本氏煙中MIP1.3基因編碼的蛋白完全相同，該蛋白為一類協(xié)助TMV侵染植物的DnaJ蛋白[25]。而B類亞家族的NbJ1與本氏煙中與PVX侵染相關(guān)的DnaJ蛋白PSL1IP2具有高度相似性[18]，與普通煙中與TSWV運(yùn)動(dòng)蛋白NSm相互作用的DnaJ蛋白NtDnaJ-M541也具有較高的相似性[16]，同源性分析結(jié)果如圖1-D所示。

2.2 寄主DnaJ基因?qū)uMV侵染的響應(yīng)

在本氏煙上注射TuMV-GFP侵染性克隆，系統(tǒng)葉出現(xiàn)黃化、卷曲、斑駁等癥狀。圖2-A顯示了接毒15 d后植株的發(fā)病情況，圖2-B為特異性引物檢測TuMV結(jié)果。以Mock為對照組，取接毒15 d植株與對照植物對應(yīng)葉位的葉片，選擇DanJ家族保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，用qPCR檢測植物內(nèi)源DanJ家族基因表量的變化。采用相對定量2^-△△Ct法分析定量數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖2-C所示，接種TuMV的植株中DnaJ基因表達(dá)量明顯上調(diào)。

A，左圖為接種TuMV 15 d的實(shí)驗(yàn)組植株，其系統(tǒng)葉出現(xiàn)卷曲、黃化和斑駁等癥狀，右圖為對照組植株生長表型；B，利用TuMV特異性引物做PCR檢測，顯示實(shí)驗(yàn)組植株被TuMV成功侵染，而對照組植株未被TuMV侵染；C，qPCR檢測本氏煙被TuMV侵染后DnaJ-like基因相對表達(dá)水平。A，The left picture showed the symptoms of systemic leaf on N.benthamiana infected by TuMV at 15 d，the right picture showed the growth phenotype of control plants; B，PCR cornfirmed the infection of TuMV; C，qPCR showed the up-regulated expression of DnaJ-like genes in TuMV-infected plants.圖2 DnaJ-like基因響應(yīng)TuMV侵染Fig.2 DnaJ-like gene responded to TuMV infection

2.3 沉默NbJ1和NbJ5基因的本氏煙表型

利用TRV介導(dǎo)的VIGS技術(shù)在本氏煙中沉默目的基因，首先在SOL GENOMIC數(shù)據(jù)庫中選定目的基因上約300 bp的區(qū)段作為VIGS區(qū)域，利用LIC技術(shù)構(gòu)建了沉默載體TRV∶NbJ1與TRV∶NbJ5。然后選定長勢相近的植株，實(shí)驗(yàn)組注射含有沉默載體TRV∶NbJ1或TRV∶NbJ5的農(nóng)桿菌，對照組注射含有TRV∶GUS載體的農(nóng)桿菌，指示植物組注射含有TRV∶PDS載體的農(nóng)桿菌(沉默PDS基因的植株出現(xiàn)明顯白化表型，結(jié)果未顯示)。

注射10 d后，沉默NbJ1的植株系統(tǒng)葉略微卷曲，無其他明顯表型；沉默NbJ5的植株出現(xiàn)系統(tǒng)葉卷曲、植株矮小的癥狀(圖3-A)。

選用特異性引物TRV-detect對實(shí)驗(yàn)組和對照組植株做PCR檢測，各組植株中均可擴(kuò)增到與對應(yīng)載體上一致的目的基因序列，表明植株均被TRV成功侵染(圖3-B)。利用qPCR檢測NbJ1與NbJ5基因表達(dá)量，將對照組植株檢測基因表達(dá)量視為1，實(shí)驗(yàn)組基因表達(dá)量分別為0.33和0.17。重復(fù)3次以上試驗(yàn)，分析發(fā)現(xiàn)NbJ1與NbJ5基因表達(dá)的穩(wěn)定值為30%，即沉默效率可達(dá)70%，確定系統(tǒng)沉默已發(fā)生(圖3-C)。

2.4 沉默NbJ1和NbJ5基因不利于TuMV侵染

分別在沉默DnaJ基因的植株和對照植株上摩擦接種TuMV(毒源為注射接種TuMV-GFP侵染性克隆后發(fā)病的本氏煙系統(tǒng)葉)，每株植物在同等葉位接種等量病毒，持續(xù)監(jiān)測病毒侵染狀況。觀察發(fā)現(xiàn)，對照組植株TuMV接種葉和系統(tǒng)葉的熒光出現(xiàn)均早于沉默NbJ1的植株，即對照組植株病毒含量更多，圖4-A顯示了接種病毒3.5 d時(shí)接種葉的發(fā)病情況，圖4-B為接種病毒6 d時(shí)植株系統(tǒng)葉的情況。分別取接種葉與系統(tǒng)葉做Western Blot檢測，結(jié)果顯示對照組GFP蛋白含量更多(圖4-C與圖4-D)，即對照組植株病毒含量多于沉默組植株。

A，TRV介導(dǎo)的本氏煙NbJ1基因沉默植株與對照組植株相比，生長表型未顯示明顯差異；本氏煙中沉默NbJ5基因植株表現(xiàn)為系統(tǒng)葉卷曲；B，PCR檢測TRV載體，結(jié)果顯示對照組植株與實(shí)驗(yàn)組植株均被TRV成功侵染；C，qPCR檢測沉默NbJ1植株、沉默NbJ5植株與對照組植株的NbJ1基因相對表達(dá)水平。A，TRV-induced NbJ1 gene silencing in N.benthamiana did not show significant differences in growth phenotypes compared with control plants; and NbJ5 silenced plants showed systematic leaf curl; B，PCR detection of TRV showed that both the control and treatment groups were successfully infected with TRV; C，qPCR detection of NbJ1 gene relative expression level in NbJ1 gene silencing plants，NbJ5 gene relative expression level in NbJ5 gene silencing plants and control plants.圖3 TRV介導(dǎo)的本氏煙NbJ1和NbJ5基因的沉默F(xiàn)ig.3 Effects of TRV-induced NbJ1 and NbJ5 silencing in N.benthamiana plants

沉默NbJ5的植株與沉默NbJ1的植株在接種TuMV后顯示了相同的癥狀，表明沉默DnaJ基因的植株中病毒侵染受到了抑制(圖5)。

3 討論

DnaJ蛋白普遍存在于生物界，在生物體內(nèi)調(diào)節(jié)多種生理活動(dòng)并參與多種病毒的侵染。DnaJ蛋白家族根據(jù)結(jié)構(gòu)不同劃分為3類亞家族，本研究在本氏煙中克隆得到了分屬DnaJ蛋白A類和B類亞家族的16條基因序列，并命名為NbJ1～NbJ14，NbJ12-2和NbJ14-2。C類亞家族蛋白C端序列高度變異，本研究未對該類基因進(jìn)行深入分析。分別對A、B兩類亞家族蛋白的典型代表NbJ5與NbJ1與來自細(xì)菌、真菌、植物與動(dòng)物等不同物種的亞家族蛋白做同源性分析，結(jié)果顯示NbJ5與植物來源的同家族DnaJ蛋白親緣關(guān)系較真菌及動(dòng)物來源的蛋白更遠(yuǎn)，這類蛋白在生物進(jìn)化中可能更為保守；NbJ1則與植物來源的同家族DnaJ蛋白同源性較高，與真菌、動(dòng)物和細(xì)菌來源的蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

NbJ1與NbJ5分別為DnaJ蛋白B類與A類亞家族典型代表，且均與參與植物病毒侵染的寄主DnaJ蛋白具有高度相似性。與NbJ1蛋白序列具有很較高相似性的DnaJ蛋白PSL1IP2與PVX的CP和復(fù)制與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)SL1相互作用，過表達(dá)或缺失該基因均可抑制病毒侵染[18]；普通煙草與該蛋白序列高度相似的蛋白NtDnaJ-M541則與TSWV的運(yùn)動(dòng)蛋白NSm相互作用[16]。NbJ5蛋白序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的MIP1.3蛋白完全相同，該蛋白在本氏煙中協(xié)助TMV侵染，且至少有2個(gè)與TMV的運(yùn)動(dòng)蛋白相互作用的區(qū)域[14]。另外，大腸埃希菌DnaJ蛋白參與BMV負(fù)義鏈RNA合成；普通煙中的DnaJ-like蛋白NtCPIP與PVY的外殼蛋白相互作用，可能參與了病毒的運(yùn)動(dòng)過程[17]。在水稻中篩選得到與RSV的運(yùn)動(dòng)蛋白PC4相互作用的DnaJ類蛋白[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)基因的沉默均不利于TuMV的侵染，說明這2個(gè)基因在TuMV侵染過程中也發(fā)揮了作用。DnaJ-like蛋白在其他病毒上的作用皆通過與病毒蛋白互作、參與病毒的復(fù)制或運(yùn)動(dòng)，因此，推測DnaJ-like蛋白可能也是通過與TuMV蛋白互作的方式來實(shí)現(xiàn)功能，后續(xù)有必要對此開展深入研究。

A，接種TuMV 3.5 d，沉默NbJ1植株與對照組植株接種葉相比，熒光斑點(diǎn)數(shù)量明顯減少；B，接種TuMV 6 d，沉默NbJ1植株與對照組植株系統(tǒng)葉相比，熒光亮度明顯減弱；C，Western blot檢測接種葉TuMV含量，結(jié)果顯示，沉默NbJ1植株接種葉病毒蛋白含量明顯少于對照組植株；D，Western blot檢測系統(tǒng)葉TuMV含量，結(jié)果顯示沉默NbJ1植株系統(tǒng)葉病毒蛋白含量明顯少于對照組植株。A，The fluorescent spots number was significantly reduced on inoculated leaves in treatment plants compared with the control plants at 3.5 d; B，The fluorescence intensity was significantly reduced on systemic leaves in treatment plants compared with the control plants at 6 d; C, Western blot analysis of inoculated leaves TuMV infected showed that the virus protein content in TRV∶NbJ1 plants was significantly less than that in the control plants; D，Western blot analysis of systemic leaves TuMV infected showed that the virus protein content in TRV∶NbJ1 plants was significantly less than that in the control plants.圖4 NbJ1系統(tǒng)沉默對TuMV侵染的影響Fig.4 Effect of NbJ1 silencing on TuMV infection

A，接種TuMV 3.5 d，沉默NbJ5植株與對照組植株接種葉相比，熒光斑點(diǎn)數(shù)量明顯減少；B，接種TuMV 6 d，沉默NbJ5植株與對照組植株系統(tǒng)葉相比，熒光亮度明顯減弱；C，Western blot檢測接種葉TuMV含量，結(jié)果顯示沉默NbJ5植株接種葉病毒蛋白含量明顯少于對照組植株；D，Western blot檢測系統(tǒng)葉TuMV含量，結(jié)果顯示沉默NbJ5植株系統(tǒng)葉病毒蛋白含量明顯少于對照組植株。A，The fluorescent spots number was significantly reduced on inoculated leaves in treatment plants compared with the control plants at 3.5 d; B, The fluorescence intensity was significantly reduced on systemic leaves in treatment plants compared with the control plants at 6 d; C，Western blot analysis of inoculated leaves TuMV infected showed that the virus protein content in TRV∶NbJ5 plants was significantly less than that in the control plants; D，Western blot analysis of systemic leaves TuMV infected showed that the virus protein content in TRV∶NbJ5 plants was significantly less than that in the control plants.圖5 NbJ5系統(tǒng)沉默對TuMV侵染的影響Fig.5 Effect of NbJ5 silencing on TuMV infection