袁濮玉，撖 榮，杜佳慧，儲(chǔ)小玲，吳 潔，楊 凡，蘇 倩，邱橋成，薛勝利△，劉松柏▲

(1.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院蘇州檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 215009；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，蘇州 215006)

FANCJ(Fanconi anemia complementation group J)基因編碼的蛋白是第1個(gè)被確認(rèn)的同乳腺癌相關(guān)腫瘤抑制因子BRCA1(breast cancer 1,early onset)相結(jié)合的蛋白，因此其最初被命名為BRCA1結(jié)合的C端解旋酶(BRCA1-associated C-terminal helicase1， BACH1)；隨后又被命名為BRCA1相互影響的蛋白C端解旋酶(BRCA1 interacting protein cterminal helicase 1，BRIP1)以避免同具有類似名稱的轉(zhuǎn)錄因子相混淆；而近年來(lái)該蛋白被發(fā)現(xiàn)是范可尼貧血(fanconi anemia，F(xiàn)A)通路的成員之一，故被稱為FANCJ蛋白[1-3]。FANCJ是一種ATP依賴的5′-3′DNA解旋酶，最初從FA和早發(fā)性乳腺癌患者中鑒定出來(lái)一些錯(cuò)義突變位點(diǎn)(A349P,R251C,Q255H，P47A，M299I等)，這暗示FANCJ蛋白可能作為腫瘤抑制因子維持基因組的穩(wěn)定性[4-5]。隨后的研究表明，F(xiàn)ANCJ蛋白在DNA鏈間交聯(lián)(interstrand cross-link，ICL)修復(fù)、復(fù)制脅迫響應(yīng)及G4-DNA結(jié)構(gòu)拆解過(guò)程中發(fā)揮重要功能[6-8]。FANCJ編碼的序列突變與乳腺癌發(fā)生緊密相關(guān)，在大量的FANCJ-like解旋酶結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)Fe-S簇結(jié)構(gòu)域，已經(jīng)證實(shí)了 FANCJ在motifⅠ、Fe-S和BRCA1互作的結(jié)構(gòu)域發(fā)生錯(cuò)義突變，與乳腺癌及FA的發(fā)生有關(guān)[9-10]。遺傳學(xué)研究證實(shí)，N端Fe-S簇結(jié)構(gòu)域(aa276-aa362)及MLH1結(jié)合區(qū)(aa128-aa158)與FANCJ解旋酶活性相關(guān)，而非BRCA1結(jié)合區(qū)[2]。體外生化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A349P、R251C、Q255H等錯(cuò)義突變失去了DNA解旋酶活性，而M299I突變體蛋白的ATP水解酶活性及DNA解旋酶活性都比野生型高，從而為闡明疾病發(fā)生的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[11-14]。

在對(duì)急性髓系白血病(AML)患者基因圖譜的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ANCJ基因的編碼區(qū)c.A587G:p.N196S位置在AML患者中出現(xiàn)了復(fù)現(xiàn)性錯(cuò)義突變。但這種突變對(duì)活性的影響尚不明確。N196S突變位于與ATP結(jié)合的區(qū)域，可能對(duì)活性造成一定影響。因此，本研究構(gòu)建了FANCJ及N196S突變體表達(dá)質(zhì)粒，并對(duì)在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)純化的蛋白進(jìn)行了DNA解旋酶活性檢測(cè)，為進(jìn)一步研究FANCJ在白血病發(fā)生過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 plvx-EF1-MCS-PGK-PURO載體購(gòu)自廣州輝駿生物科技有限公司，F(xiàn)ANCJwt編碼區(qū)全長(zhǎng)基因特異性引物(FANCJF:5′-TCG AGC TCA AGC TTC GAA TTC ATG TCT TCA ATG TGG TCT G-3′;FANCJR:5′-TTA TCT AGA GTC GCG GGA TCC TTA CTT AAA ACC AGG AAA CAT G-3′),N196S點(diǎn)突變構(gòu)建特異性引物(FANCJ-N196S/F:5′-GTA AAA CTC AGC TCT CCA CTG-3′;FANCJ-N196S/R:5′-AGT CTT TCC TGA ATC AAC-3′)，以及熒光標(biāo)記DNA底物均在華大基因科技公司合成；HEK293T細(xì)胞購(gòu)自上海拜力生物科技公司，大腸桿菌感受態(tài)DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司，Polyjet購(gòu)自美國(guó)SignaGen公司，限制性內(nèi)切酶ECORⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、DpnⅠ及T4 DNA連接酶均購(gòu)自美國(guó)NEB公司，ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit連接酶購(gòu)自諾唯贊生物公司，PCR、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生物公司，F(xiàn)lag單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗、3xFlag肽段購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，M2 Beads購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，銀染試劑盒購(gòu)自碧云天生物公司。細(xì)胞培養(yǎng)基及血清的細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑均購(gòu)自四季青公司。

1.2 方法

1.2.1 FANCJwt及N196S突變體真核表達(dá)載體的構(gòu)建 選取HEK293T細(xì)胞來(lái)源的cDNA片段，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增出相應(yīng)的FANCJwt編碼區(qū)全長(zhǎng)片段，瓊脂糖電泳鑒定DNA條帶并膠回收。ECORⅠ、BamHⅠ雙酶切plvx-EF1-MCS-PGK-PURO載體，并純化回收酶切產(chǎn)物。將酶切后的表達(dá)載體及PCR酶切片段利用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中，并涂到帶有氨芐抗性的LB平板上，在37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜，挑選單個(gè)菌落進(jìn)行質(zhì)粒酶切，測(cè)序驗(yàn)證成功的質(zhì)粒用于后續(xù)N196S突變體質(zhì)粒的構(gòu)建及接下來(lái)的轉(zhuǎn)染。N196S突變體質(zhì)粒以FANCJwt質(zhì)粒為模板，利用點(diǎn)突變引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行DpnⅠ酶解,然后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中進(jìn)行與以上相同的后續(xù)檢測(cè)操作。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，前1 d細(xì)胞鋪于15 cm培養(yǎng)板中，等細(xì)胞密度至70%～80%時(shí)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染FANCJwt及N196S表達(dá)質(zhì)粒(按照美國(guó)SignaGen公司的Polyjet轉(zhuǎn)染說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染)。

1.2.3 提取總蛋白及蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè) 轉(zhuǎn)染36～48 h后，棄掉上清液培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞3次。刮刀收集細(xì)胞并加入適量RIPA裂解液，振蕩15 s后置于冰上30 min。12 000×g于4 ℃離心30 min，將裂解液上清液轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)新的EP管中，利用二辛可寧酸(BCA)方法進(jìn)行蛋白定量。取50 μg總蛋白經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠分離，100 V情況下利用濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h,磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜3次，每次10 min。加入一抗anti-Flag抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠(1∶2 000)二抗室溫孵育1.5 h，PBST洗膜3次，每次10 min。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色和發(fā)光(Odyssey Fc成像儀，Gene公司，美國(guó))。

1.2.4 免疫沉淀純化蛋白與PAGE銀染 FANCJwt及突變體N196S表達(dá)質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染36～48 h后收集細(xì)胞，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃離心獲得總蛋白上清液，在上清液中加入20 μL M2 Beads，4 ℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜，利用預(yù)冷PBS漂洗M2 Beads 3次，然后加入30 μL 3xFlag肽段競(jìng)爭(zhēng)洗脫Flag-FANCJwt及Flag-N196S蛋白，獲得的純化蛋白用于活性檢測(cè)及PAGE膠銀染(按照碧云天生物公司的快速銀染說(shuō)明書進(jìn)行銀染)。

1.2.5 DNA解旋酶活性檢測(cè) DNA解旋酶活性檢測(cè)采用熒光標(biāo)記Oligo DNA底物的方法，上下游oligo序列為：DC26(上游)，5′-TAMRA TTT TTT TTT TTT TTT TTT TCC CAG TAA AAC GAC GAC GGC CAG TGC-3′；Tstem25(下游)，5′-GCA CTG GCC GTC GTT TTA CGG TCG TGA CTG GGA AAA CCC TGG CG3-3′。反應(yīng)前將退火后的DNA底物及反應(yīng)緩沖液混合在一起，30 ℃情況下水浴反應(yīng)1 h，然后用加入乙二胺四乙酸(EDTA)及蛋白酶K的6×DNA上樣緩沖液進(jìn)行終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)非變性PAGE膠進(jìn)行分離，分離后的結(jié)果通過(guò)熒光成像儀進(jìn)行觀察(Odyssey Fc成像儀，Gene公司)。

2 結(jié) 果

2.1 通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得FANCJwt基因cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng) 以HEK293T細(xì)胞來(lái)源的cDNA片段為模板，應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行人源FANCJwt基因PCR擴(kuò)增，可見(jiàn)3.7×103大小的特異性片段，見(jiàn)圖1。

2.2 FANCJwt真核表達(dá)載體及N196S突變體構(gòu)建鑒定 利用FANCJwt表達(dá)質(zhì)粒為模板，通過(guò)點(diǎn)突變引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，鑒定FANCJ基因cDNA 第587位由 A突變?yōu)?G，相應(yīng)氨基酸由N(天冬氨酸)突變?yōu)镾(絲氨酸)，突變成功。FANCJwt及N196S真核表達(dá)載體plvx-EF1-MCS-PGK-PURO，經(jīng)XbaⅠ酶切后得到約2.5×103(片段)及9.9×103(載體)的兩條條帶。見(jiàn)圖2。

M:DNA分子標(biāo)記物;N1:陰性對(duì)照組1;N2:陰性對(duì)照組2;1:PCR產(chǎn)物

圖1目的基因PCR擴(kuò)增

M:DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶; 1:FANCJwt;2:FANCJ 質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ酶切產(chǎn)物; 3:FANCJwt;4:N196S質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ酶切產(chǎn)物

圖2酶切驗(yàn)證(A)及突變測(cè)序驗(yàn)證(B)

2.3 FANCJwt及N196S突變體蛋白在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá) 將構(gòu)建成功的FANCJwt及N196S突變體表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，Western blot檢測(cè)到蛋白的成功表達(dá)，見(jiàn)圖3A。

圖3 Western blot檢測(cè)(A)及蛋白純化銀染成像(B)

2.4 免疫沉淀方法純化FANCJwt、N196S突變體蛋白及PAGE膠銀染 FANCJwt及突變體N196S表達(dá)質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)后收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞并提前總蛋白，使用M2 Beads沉淀帶Flag標(biāo)簽的FANCJwt及突變體N196S蛋白，然后通過(guò)3xFlag肽段將蛋白競(jìng)爭(zhēng)洗脫下來(lái)，洗脫下來(lái)的蛋白經(jīng)銀染染色，檢測(cè)到明顯的FANCJwt及突變體N196S蛋白條帶，見(jiàn)圖3B。

2.5 DNA解旋酶活性檢測(cè) 采用熒光標(biāo)記Oligo DNA底物的方法(圖4A)，對(duì)FANCJwt及突變體N196S蛋白進(jìn)行了DNA解旋酶活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與FANCJwt野生型相比，N196S突變體活性明顯增強(qiáng)，并疑似具有額外核酸酶活性(產(chǎn)物2)，見(jiàn)圖4B。

圖4 DNA底物(A)及解旋酶活性檢測(cè)(B)

3 討 論

FANCJ在FA、乳腺癌及急性髓系白血病中都存在復(fù)現(xiàn)性的錯(cuò)義突變。因此，在不同類型的癌癥中，F(xiàn)ANCJ都被認(rèn)為參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，受到了廣泛關(guān)注。FANCJ具有DNA解旋酶活性，參與包括FA通路在內(nèi)的多個(gè)DNA修復(fù)通路，在多種癌癥患者中檢測(cè)到的錯(cuò)義突變體也顯示與DNA解旋酶活性的改變相關(guān)[5,10]。本課題組前期研究中在急性髓系白血病患者中檢測(cè)到了一種復(fù)現(xiàn)性的N196S錯(cuò)義突變，位于與ATP結(jié)合的區(qū)域，靠近Fe-S結(jié)構(gòu)域及與MLH1結(jié)合的區(qū)域，之前少見(jiàn)報(bào)道，對(duì)FANCJ功能的具體影響目前尚不清楚。因此構(gòu)建FANCJWT及其突變體的表達(dá)載體，純化蛋白并檢測(cè)蛋白的解旋酶活性，將為后續(xù)FANCJ在白血病發(fā)生過(guò)程的研究中奠定基礎(chǔ)[12]。本研究中，采用HEK293T細(xì)胞來(lái)源的cDNA片段作為模板擴(kuò)增出相應(yīng)的FANCJwt基因序列，將其與plvx-EF1-MCS-PGK-PURO真核表達(dá)載體相連，并以此FANCJWT野生型表達(dá)質(zhì)粒為模板，構(gòu)建了N196S表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞。通過(guò)Western blot及銀染檢測(cè)證明成功表達(dá)純化了兩種蛋白。后續(xù)通過(guò)熒光標(biāo)記DNA底物的方法成功檢測(cè)到FANCJwt及N196S突變體蛋白解旋酶活性存在差異性，這為后續(xù)研究FANCJ突變導(dǎo)致白血病發(fā)生的機(jī)制奠定基礎(chǔ)?？傊狙芯拷Y(jié)果將為進(jìn)一步研究FANCJWT及N196S突變體在急性髓系白血病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為研究FANCJ生物學(xué)功能提供了新的思路。