張建敏，趙 東，鄭 佳，彭志云，楊康卓，劉 芳

(宜賓五糧液股份有限公司技術(shù)研究中心，四川宜賓644007)

濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程是一種多菌種參與的固態(tài)發(fā)酵過(guò)程。來(lái)自曲藥、窖泥及發(fā)酵環(huán)境的多種微生物（細(xì)菌、酵母和霉菌）以酒醅為載體，在白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝，生成各類代謝產(chǎn)物和風(fēng)味物質(zhì)。糟醅的發(fā)酵過(guò)程不僅僅包含了曲藥微生物在窖池內(nèi)從有氧發(fā)酵到厭氧發(fā)酵的過(guò)程，同時(shí)包含了曲藥微生物與窖泥微生物在糟醅與窖泥接觸的界面上的相互代謝作用[1-3]。五糧濃香的雙輪底發(fā)酵，極大程度延長(zhǎng)了窖池內(nèi)窖泥與糟醅的厭氧接觸時(shí)間，糟醅與窖泥間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、微生物的交換，形成了“以窖養(yǎng)糟、以糟促窖、糟窖互養(yǎng)”的良好互動(dòng)局面[4-5]。傳統(tǒng)的釀酒經(jīng)驗(yàn)告訴我們，窖池邊糟（即糟醅與窖泥接觸部分的糟醅）中的風(fēng)味物質(zhì)的濃度顯著高于中心糟（未與窖泥接觸的糟醅）。然而，迄今還沒(méi)有開展糟醅微生物與窖泥微生物的相互代謝關(guān)系的研究。

為了解析濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程糟醅微生物與窖泥微生物的相互代謝關(guān)系，本研究模擬白酒窖內(nèi)糟醅發(fā)酵情況，以五糧粉液體培養(yǎng)基作為載體，添加窖泥富集菌液與生產(chǎn)用曲粉，梯度培養(yǎng)并按設(shè)置節(jié)點(diǎn)取樣，并利用氣質(zhì)聯(lián)用儀分析發(fā)酵過(guò)程中主要風(fēng)味物質(zhì)，以期確定主要風(fēng)味物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，并找到糟醅微生物與窖泥微生物的相互代謝關(guān)系。通過(guò)模擬發(fā)酵解析酒醅發(fā)酵過(guò)程中主要風(fēng)味物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化關(guān)系，可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)闡明酒醅中微生物產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)機(jī)理，定向調(diào)控白酒生產(chǎn)中的主要風(fēng)味物質(zhì)的合成提供理論依據(jù)和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：五糧粉制備參考文獻(xiàn)[6]，窖泥富集液制備參考文獻(xiàn)[7]。

接種、培養(yǎng)及取樣方式見表1。

主要儀器與試劑：立式高壓蒸汽滅菌鍋為YXQ-LS，購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；生物安全柜為ESCO Class II，購(gòu)自珠海市珠峰儀器儀表有限公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀為6890N-5973MSD，購(gòu)自安捷倫科技有限公司；二氯甲烷為ACS級(jí)，購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；4-辛醇為GC級(jí)，購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液液微萃取法(LLME)

準(zhǔn)確量取15 mL發(fā)酵過(guò)濾液于試管中，加入適量NaCl飽和，再加入1.5 mL重蒸CH2Cl2，振蕩萃取10 min，靜置一段時(shí)間，吸取1.5 mL萃取物離心，吸取下層萃取物0.5 mL。

1.2.2 GC-MS分析條件

GC條件：DB-Wax（30.0 m長(zhǎng)×0.25 mm內(nèi)徑×0.25 μm膜厚，J&W，美國(guó)）毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度250℃，不分流進(jìn)樣，載氣He流速1 mL/min；升溫程序：起始溫度40℃，保持5 min，以4℃/min升至230℃，保持15 min。

MS條件：EI源，電子能量70 eV；離子源溫度200℃，四級(jí)桿溫度150℃，質(zhì)量數(shù)掃描范圍35～350 amu。

1.2.3 化合物鑒定與半定量分析

化合物鑒定采用參考文獻(xiàn)[8]所述方法進(jìn)行化合物定性；單個(gè)化合物的相對(duì)含量采用其與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的比進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵結(jié)束時(shí)揮發(fā)性成分總離子流圖（圖1）

本研究利用LLME法提取發(fā)酵液中的香氣成分，不同發(fā)酵液的色譜圖差異較明顯（圖1）。半定量風(fēng)味物質(zhì)共26種，包括醇類7種、酸類6種、酯類12種、酮類1種，其占總量比分別為72.17%、5.97%、21.55%、0.31%，且均為白酒基酒中已檢出的化合物。由此說(shuō)明在模擬發(fā)酵體系下1#、2#、3#發(fā)酵結(jié)束時(shí)，所產(chǎn)最多的揮發(fā)性物質(zhì)均為醇類，其次為酯類，出現(xiàn)這種情況可能與培養(yǎng)基質(zhì)偏酸更適合酵母生長(zhǎng)有關(guān)。由圖2可知，1#、2#、3#所半定量的主要揮發(fā)性物質(zhì)總量的比值為3.3∶1.5∶1，2#與3#的揮發(fā)性物質(zhì)的熱圖聚為一簇，說(shuō)明兩者之間的風(fēng)味風(fēng)格有一定的相似性。

2.2 醇類

表1 接種、培養(yǎng)及取樣方式

本研究中，醇類化合物7種，包括苯乙醇、異戊醇、異丁醇、正己醇、正丙醇、正丁醇、3-甲基-2-丁醇，其占醇類比重分別為73.95%、23.68%、2.11%、0.20%、0.03%、0.02%，均為白酒基酒中已檢出化合物。發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)醇類（苯乙醇、異戊醇、異丁醇、正己醇）在發(fā)酵中整體呈現(xiàn)一個(gè)積累增加的過(guò)程（圖3）。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)醇含量的積累量比值為1#∶2#∶3#=3.9∶1.7∶1，說(shuō)明大曲粉的微生物代謝五糧粉培養(yǎng)基產(chǎn)生的醇類物質(zhì)最多。這是由于大曲粉中酵母菌的數(shù)量顯著多于2#，因而1#發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)醇類積累量遠(yuǎn)高于2#；2#發(fā)酵液中也有相當(dāng)量?jī)?yōu)勢(shì)醇的積累，這可能是由于窖泥長(zhǎng)期與糟醅接觸，兩者中微生物的互動(dòng)致使糟醅中的酵母進(jìn)入窖泥，從而形成一定的產(chǎn)醇能力。值得注意的是，3#發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)醇類積累量均少于1#和2#，減少幅度分別為289.32%和70.61%，說(shuō)明混菌培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)勢(shì)醇類的積累量受到很大程度的抑制，但抑制的機(jī)理仍待進(jìn)一步探討。由于醇類物質(zhì)具有典型的水果香、花香味[9]，不僅是酒中醇甜和助香劑的主要物質(zhì)，也是形成香味物質(zhì)的前驅(qū)物質(zhì)，對(duì)白酒的風(fēng)味有一定的作用，但是其含量必須控制在一定范圍內(nèi)。含量過(guò)少會(huì)失去傳統(tǒng)白酒的風(fēng)格，過(guò)多會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品辣、苦、澀，給酒帶來(lái)不良的影響[10]。所以，在濃香型白酒釀造過(guò)程中對(duì)醇類物質(zhì)的調(diào)控顯得尤為重要。

圖1 發(fā)酵結(jié)束主要物質(zhì)總離子流圖

圖2 發(fā)酵結(jié)束時(shí)主要物質(zhì)熱圖

圖3 發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)醇類含量變化趨勢(shì)

圖4 發(fā)酵過(guò)程中四大酸含量變化

圖5 發(fā)酵過(guò)程中四大酯含量變化

2.3 酸類

酸類物質(zhì)既是白酒的主要協(xié)調(diào)成分，也是重要的呈味物質(zhì)，還是酒中酯類的前體物質(zhì)。白酒中酸量過(guò)少，酒味寡淡，后味短；酸量過(guò)大，酸味露頭，酒味粗糙，甚至入口有尖酸味；適量的有機(jī)酸可使酒體豐滿、醇厚，回味悠長(zhǎng)[11]。

本研究中定量檢測(cè)了6種酸類化合物，包括乙酸、辛酸、己酸、庚酸、3-甲基丁酸和丁酸，占酸類比重分別為64.96%、17.12%、8.81%、4.70%、3.23%和1.18%，且均為白酒中常見的有機(jī)酸。對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)酸類（乙酸、辛酸、己酸、庚酸）的定量結(jié)果可知，發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)酸在發(fā)酵過(guò)程中也呈增加的的趨勢(shì)（圖4）。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)酸含量的積累量比值為1#∶2#∶3#=2.5∶4.2∶1。由于窖泥中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)微生物為細(xì)菌，大部分為產(chǎn)酸細(xì)菌[11]，使得2#發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)酸積累量遠(yuǎn)高于1#；1#發(fā)酵液中也有一定量?jī)?yōu)勢(shì)酸的積累，這可能是大曲發(fā)酵液中含有細(xì)菌產(chǎn)酸所致；3#發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)酸積累量均少于1#和2#，減少幅度分別達(dá)到149.65%和318.35%，說(shuō)明混菌培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)勢(shì)酸的積累量也受到很大程度的抑制，但抑制的機(jī)理仍不清楚。

2.4 酯類

棕櫚酸乙酯、乳酸乙酯、亞油酸乙酯、十四酸乙酯是主要的酯類物質(zhì)，其占酯類比重分別為37.76%、34.07%、9.70%、9.27%。主要乙酯在發(fā)酵中的變化趨勢(shì)與酸、醇的變化結(jié)果基本一致（圖5）。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，主要乙酯的積累量比值為1#∶2#∶3#=2.3∶0.9∶1。大曲粉中含有大量的酵母菌，另外，制曲的原料是小麥，小麥本身含有大量的棕櫚酸、油酸等，在大曲粉發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌所含的酯化酶系可將乙醇和這類有機(jī)酸酯化產(chǎn)生相應(yīng)的乙酯，使得主要乙酯含量高于2#；3#發(fā)酵液中主要乙酯積累量少于1#（-132.01%），而與2#基本持平，說(shuō)明當(dāng)大曲微生物與窖泥微生物混合培養(yǎng)時(shí)，大曲粉中酵母菌的酯化能力受到一定程度的抑制。

3 結(jié)論

本研究利用LLME-GC/MS探討了大曲微生物與窖泥微生物在模擬發(fā)酵體系中主要揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律，研究結(jié)果表明，在模擬發(fā)酵體系中大曲微生物、窖泥微生物、混合發(fā)酵所產(chǎn)主要揮發(fā)性物質(zhì)是醇類。混菌培養(yǎng)條件下發(fā)酵液中酸類、醇類、酯類的積累均受到相當(dāng)大程度的抑制。風(fēng)味物質(zhì)與微生物群落間的關(guān)聯(lián)性以及窖池內(nèi)微生物的代謝規(guī)律特征將是我們后續(xù)研究工作的重點(diǎn)。