張大為，張 潔，閆 佳，田永航，裴志勝

（海南熱帶海洋學(xué)院生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院，海南省海洋食品工程技術(shù)研究中心，海南三亞572022）

余甘果又名“油甘”“望果”“余甘子”“牛甘果”等，是大戟科葉下珠屬落葉小喬木或灌木。后味甘甜，微酸，具有保肝護(hù)肝、抗衰老、健胃消食等功能。它不僅具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且還有藥用價(jià)值，并被載入《中華人民共和國(guó)藥典》[1]。余甘果原產(chǎn)于印度、印度尼西亞等國(guó)，早在2000多年前我國(guó)就有種植，并被廣泛認(rèn)知。余甘果樹主要生長(zhǎng)在福建南部、廣東、廣西、云南、臺(tái)灣等地區(qū)，其中福建南部及廣西分布較多。余甘果是一種生命力極頑強(qiáng)的植物，其果實(shí)可以在常溫下放置一個(gè)多月仍保持不腐爛[2]。

余甘果的營(yíng)養(yǎng)極為豐富，果實(shí)中含有較高的維生素C、維生素B、蛋白質(zhì)、果酸、脂肪酸、十幾種微量元素和十幾種氨基酸[3]等。余甘果本身具有的價(jià)值已經(jīng)引起全世界人民的高度重視。余甘果在我國(guó)南方廣為流傳，據(jù)《本草綱目》中記載，“久服余甘汁，可以輕身，延年長(zhǎng)生”。市場(chǎng)上也出現(xiàn)了各式各樣的余甘果產(chǎn)品，其中余甘果蜜餞最為流行，不僅口感好，而且價(jià)格也合理，具有很好的開發(fā)前景[4-6]。余甘果有較高的藥用價(jià)值，不僅具有抗衰老作用，而且有健胃消食、抗菌消炎、生津止咳、有效止瀉、減緩惡心和治療月經(jīng)失調(diào)等功能。“余甘鹵”在我國(guó)民間依然是家中常備的藥品，它是以余甘果加部分甘草浸泡在鹽水中制成的，常用于治療消化不良、痛經(jīng)、風(fēng)寒、厭食、肚痛腹瀉和惡心嘔吐等常見的疾病[7-8]。

果酒釀造過程中，傳統(tǒng)的抗菌劑是SO2，研究發(fā)現(xiàn)SO2會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生危害，所以找到能夠替代SO2的物質(zhì)是亟待解決的問題[9-11]。大量研究表明，很多植物能夠起到很好的抗菌作用，比如黃檗、肉桂。從植物中尋找適合于果酒釀造的天然抗菌劑已經(jīng)成為可能，有望替代傳統(tǒng)的抗菌劑[12-13]。另外，很多人在飲酒后會(huì)出現(xiàn)面紅、惡心等癥狀，主要原因是乙醛所帶來的影響，其傷害程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于乙醇。研究發(fā)現(xiàn)，多種植物具有解酒護(hù)肝的功能，比如人參、葛根、巴西莓等。其作用機(jī)制是通過抑制胃腸吸收乙醇和加速代謝以降低機(jī)體血醇濃度[14-17]。鑒于余甘果所具有的特殊營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，本試驗(yàn)著重研究余甘果對(duì)腐敗菠蘿酒中腐敗細(xì)菌的抑制作用以及其對(duì)乙醛脫氫酶作用效果的影響，為余甘果在釀酒、解酒等方面的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

余甘果，市售。

細(xì)菌培養(yǎng)基：稱量牛肉膏1.5 g、蛋白胨3.0 g、NaCl 1.5 g、瓊脂6.0 g，再加入清水300 mL煮沸，調(diào)節(jié)pH7.0。

試劑：乙醛（40%，分析純），購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙醛脫氫酶，sigma公司；碘、碘化鉀、亞硫酸氫鈉、淀粉、草酸銨、結(jié)晶紫、番紅等試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：BSP-400型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備廠；AUY-120型分析天平，日本島津公司；PB-10型pH計(jì)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；YXQ-LS-75SII型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SZX10攝影顯微鏡，日本OLYMPUS。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 腐敗菠蘿酒中腐敗菌的分離及初步鑒定

取少量菠蘿酒放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至出現(xiàn)異味及表面出現(xiàn)大量菌膜。利用稀釋平板法分離腐敗菠蘿酒中的腐敗細(xì)菌，先對(duì)腐敗酒原液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)分別為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，分別取0.1 mL上述濃度的稀釋液涂平板，37℃倒置培養(yǎng)72 h，挑取單菌落進(jìn)行分離純化。每個(gè)梯度做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)[13]。

通過菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、革蘭氏染色等方法，對(duì)所分離的腐敗細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。

1.2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

菌懸液制備：將分離得到的腐敗菌用無(wú)菌水稀釋，調(diào)整其濃度為106個(gè)/mL，備用。

細(xì)菌平板制備：取9 cm的平皿，倒入10 mL的細(xì)菌固體培養(yǎng)基，待其凝固后通過涂布法將0.1 mL的菌懸液均勻涂布于培養(yǎng)基表面，靜置備用。

抑菌實(shí)驗(yàn)：以濾紙片抑菌法為參考，對(duì)其加以改進(jìn)，方法如下：制備直徑為6 mm，厚度為2 mm的余甘果果肉圓片，用無(wú)菌水沖洗，去除多余水分。將余甘果片放在制備好的細(xì)菌平板上，并以直徑為6 mm的無(wú)菌濾紙片作為對(duì)照。

表1 腐敗菌的特征

1.2.3 乙醛測(cè)定方法

利用CH3CHO與過量的NaHSO3發(fā)生加成反應(yīng)，待反應(yīng)完全后，進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)，用配制好的I2標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定剩余NaHSO3的量，并同時(shí)做空白滴定實(shí)驗(yàn)。通過NaHSO3反應(yīng)前后的變化，即I2標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定時(shí)所消耗的體積之差，則可以計(jì)算出乙醛的含量[15]。

計(jì)算公式：

式中：V2——空白實(shí)驗(yàn)滴定時(shí)所消耗的I2標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

V1——樣品滴定消耗I2標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

C——I2標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；

G——乙醛樣品稱樣量，g；

22.02——乙醛化學(xué)反應(yīng)基本單元，g/mol。

1.2.4 余甘果果肉輔助乙醛降解特性的研究方法

1.2.4.1 余甘果果肉對(duì)乙醛降解率的影響

取干燥的具塞試管3支，分別編號(hào)為1、2、3，在1號(hào)試管（對(duì)照組）中加入5 mL乙醛（40%），2號(hào)試管中加入5 mL乙醛（40%）、0.1 g乙醛脫氫酶，3號(hào)試管中加入5 mL乙醛（40%）、0.1 g乙醛脫氫酶和1.0 g余甘果果肉，混勻蓋緊塞子，37℃放置10 h，然后測(cè)定乙醛含量。每組實(shí)驗(yàn)均做3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.2 余甘果果肉添加量的確定實(shí)驗(yàn)

取干燥的具塞試管5支，分別編號(hào)為1、2、3、4、5，在所有試管中加入5 mL乙醛（40%）和0.1 g乙醛脫氫酶。1號(hào)試管作為空白對(duì)照，2、3、4、5號(hào)試管分別加入0.5 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g余甘果果肉，混勻蓋緊塞子，在37℃下放置10 h，然后測(cè)定乙醛含量。每組實(shí)驗(yàn)均做3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.3 不同反應(yīng)溫度對(duì)乙醛降解率的影響

取干燥的具塞試管3支，分別編號(hào)為1、2、3，在3支試管中均加入5 mL乙醛、0.1 g乙醛脫氫酶和1.5 g余甘果果肉，分放在30℃、37℃和40℃下放置10 h，然后測(cè)定乙醛含量。每組實(shí)驗(yàn)均做3組平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿酒中腐敗菌的分離及初步鑒定結(jié)果

分離得到4種腐敗菌，4種腐敗細(xì)菌特征見表1和圖1。

圖1 4種腐敗菌的顯微鏡圖片

由圖1可看出，1號(hào)和2號(hào)菌呈短桿狀，3號(hào)和4號(hào)為球狀，根據(jù)其菌落形態(tài)、菌體形態(tài)等特征判斷，具有細(xì)菌的典型性，均為單細(xì)胞。

2.2 余甘果果肉對(duì)菠蘿酒腐敗菌的抑制結(jié)果

用抑菌圈法測(cè)定余甘果果肉對(duì)菠蘿酒腐敗細(xì)菌，對(duì)4種主要腐敗細(xì)菌的抗性見圖2。

如圖2所示，余甘果對(duì)腐敗菌1、腐敗菌2和腐敗菌4均有不同程度的抑制作用，從抑菌圈大小看，對(duì)腐敗菌1的抑制作用最強(qiáng)，其次是腐敗菌2，最后是腐敗菌4，其平均抑菌圈直徑見表2，分別是15.5 mm、12.8 mm和11.5 mm。余甘果果肉對(duì)細(xì)菌3沒有抑制作用，抑菌圈直徑為0 mm。將4種細(xì)菌分別用滅菌的菠蘿汁培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，1號(hào)菌發(fā)酵液具有明顯的腐臭味，應(yīng)該是某種導(dǎo)致水果腐爛的細(xì)菌；2號(hào)菌發(fā)酵液具有明顯的刺激性酸味，表面有一層薄膜，由此判斷可能是某種醋酸菌；4號(hào)細(xì)菌無(wú)明顯腐爛和酸的味道，但是有令人不愉快的氣味。結(jié)合以上抗菌實(shí)驗(yàn)可以說明，余甘果對(duì)菠蘿酒腐敗菌具有很好的抗性。余甘果果肉對(duì)3號(hào)細(xì)菌無(wú)抑制作用，接種到菠蘿汁中發(fā)酵后，發(fā)酵液具有令人愉快的香氣。綜上所述，可以推斷余甘果在菠蘿酒釀造中有潛力作為抗菌物質(zhì)來使用。

圖2 余甘果對(duì)4種腐敗細(xì)菌的抑制結(jié)果

表2 余甘果對(duì)4種細(xì)菌的抑菌效果

2.3 余甘果果肉對(duì)乙醛降解率的影響（圖3）

由圖3可知，對(duì)照組是只加了5 mL的乙醛（40%），經(jīng)過10 h后，降低到33.88%。乙醛+乙醛脫氫酶實(shí)驗(yàn)組中，由于乙醛脫氫酶作用，經(jīng)10 h的反應(yīng)后乙醛含量降低到18.24%，其轉(zhuǎn)化率為46.16%。在乙醛+乙醛脫氫酶+余甘果果肉實(shí)驗(yàn)組中，由于余甘果果肉的加入，乙醛含量降為16.54%，乙醛轉(zhuǎn)化率51.18%，比乙醛+乙醛脫氫酶的實(shí)驗(yàn)組增加5.02%。由此可以說明，余甘果對(duì)乙醛脫氫酶降解乙醛具有輔助增強(qiáng)的作用，可能是增強(qiáng)了乙醛脫氫酶的活力。

圖3 余甘果對(duì)乙醛降解率的影響結(jié)果

圖4 余甘果果肉不同添加量對(duì)乙醛降解率的影響

2.4 余甘果果肉添加量對(duì)乙醛降解率的影響（圖4）

如圖4所示，余甘果果肉添加量分別為0.5 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g時(shí)，經(jīng)過10 h的作用后，乙醛的含量呈逐漸降低的趨勢(shì)，與對(duì)照組（只含有乙醛和乙醛脫氫酶）相比，乙醛含量均有不同程度的降低，說明在乙醛脫氫酶和余甘果果肉的共同作用下乙醛降解。余甘果果肉添加量為1.5 g時(shí)，乙醛含量為14.67%，其轉(zhuǎn)化率為56.70%。當(dāng)果肉量繼續(xù)增加到2.0 g時(shí)，乙醛含量變化不大，說明添加余甘果1.5 g/5 mL 40%乙醛（即0.3 g/mL 40%乙醛）時(shí)是最恰當(dāng)?shù)摹?/p>

2.5 不同溫度對(duì)乙醛降解效果的影響（圖5）

如圖5所示，在同時(shí)添加5 mL乙醛（40%）、0.1 g乙醛脫氫酶和1.5 g余甘果果肉的情況下，分別測(cè)試不同溫度下乙醛的降解效果，37℃時(shí)降解效果最好，其次是40℃，降解效果最差的是30℃，由此說明37℃是最適合酶和余甘果共同作用的溫度。由于30℃是實(shí)驗(yàn)中較低的溫度，所以相對(duì)于37℃、40℃而言揮發(fā)量減少，測(cè)定值比較高。可見，比最適溫度高的溫度不利于乙醛脫氫酶和余甘果果肉共同降解乙醛。

圖5 不同溫度對(duì)乙醛降解率的影響

3 結(jié)論

從腐敗的菠蘿酒中分離得到4種腐敗菌，經(jīng)初步鑒定為細(xì)菌，分別為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)，余甘果果肉對(duì)1號(hào)、2號(hào)和4號(hào)細(xì)菌具有較為強(qiáng)烈的抑制作用，抑菌圈直徑分別為15.5 mm、12.8 mm和11.5 mm，對(duì)3號(hào)細(xì)菌無(wú)抑制作用。結(jié)果表明，余甘果果肉具有抑制菠蘿酒腐敗的潛力。通過實(shí)驗(yàn)表明，余甘果能夠輔助乙醛脫氫酶降解乙醛，只添加乙醛脫氫酶時(shí)，乙醛的轉(zhuǎn)化率為46.16%，同等條件下添加余甘果以后，乙醛的轉(zhuǎn)化率為51.18%，轉(zhuǎn)化率提高了5.02%。余甘果果肉的最適添加量為1.5 g/5 mL 40%乙醛（即0.3 g/mL 40%乙醛），余甘果和乙醛脫氫酶的最適作用溫度為37℃。