梅 希，吳錦林，黎 瑤，邱 平

(1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，成都 610500；2．重慶市中醫(yī)院/重慶市中醫(yī)研究院內(nèi)分泌與代謝病科 400021)

目前，糖尿病腎病(DN)的發(fā)病機(jī)制仍沒有完全闡明，現(xiàn)在公認(rèn)的主要機(jī)制有：腎臟血流動力學(xué)改變、高血糖誘導(dǎo)的終末糖基化產(chǎn)物堆積、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)等。既往關(guān)于氧化應(yīng)激方面的研究已證實(shí)，糖尿病、高血壓患者存在血管內(nèi)皮功能障礙，其血清中非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)水平明顯升高。約85%的ADMA主要由蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(PRMT1)催化生成，約75%的ADMA則由二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(DDAH1)水解，即形成1條PRMT1-ADMA-DDAH1代謝軸[1-2]。既往研究證明這條代謝軸存在于糖尿病患者胰腺、眼及腎臟組織中[3-5]。二肽基肽酶-4(DDP-4)抑制劑是目前臨床上使用的一種新型降糖藥物，其主要作用機(jī)制是通過抑制胰高糖素樣肽-1的分解，從而促進(jìn)胰島β細(xì)胞對胰島素的釋放。在眾多DPP4抑制劑中，利格列汀由于其對肝腎功能影響小，且能控制體質(zhì)量增加，所以廣泛用于糖尿病的降糖治療中。既往已有研究證實(shí)，在替米沙坦治療基礎(chǔ)上加用利格列汀可有效減少DN患者的蛋白尿。為此推測利格列汀除降糖作用外，還可能具有保護(hù)腎臟的作用。另外，利格列汀對腎臟中PRMT1的影響少見相關(guān)報(bào)道。本研究建立2型糖尿病伴早期DN的大鼠模型，通過單用利格列汀干預(yù)治療，探討其能否通過抑制PRMT1而起到保護(hù)腎功能的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 30只清潔及體質(zhì)量為(170.30±10.09)g的雄性SD大鼠，購于成都醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，在基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)和自由進(jìn)水進(jìn)食的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中飼養(yǎng)并適應(yīng)1周，隨機(jī)分為觀察組(n=20)和正常對照組(NC組，n=10)。觀察組給予高糖、高脂飼料飼養(yǎng)，NC組給予普通飼料飼養(yǎng)。

1.2分組 4周后，分別在觀察組和NC組SD大鼠腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(STZ)溶液(STZ，30 mg/kg,Sigma公司)和相應(yīng)體積的檸檬酸緩沖液。1周后分別經(jīng)尾靜脈采血檢測空腹血糖(FBG)(標(biāo)準(zhǔn)：以禁食后血糖水平>7.8 mmol/L判定觀察組2型糖尿病大鼠模型建模成功)。隨機(jī)將觀察組分為糖尿病組(DM組，n=10)和糖尿病利格列汀治療組(LM組，n=10)。LM組以利格列汀[3 mg/(kg·d)，美國禮來公司]經(jīng)口灌胃，相應(yīng)劑量的蒸餾水給予NC組和DM組。12周后，收集24 h尿液，將大鼠隔夜禁食稱重并經(jīng)乙醚麻醉后，從腹主動脈留取血液并分離腎臟標(biāo)本。

1.3方法

1.3.1相關(guān)指標(biāo)檢測和計(jì)算 采用葡萄糖氧化酶法測定FBG；采用放射免疫法檢測空腹胰島素(FINS)、肌酐(Cr)、24 h尿微量清蛋白(24 h mALB)及尿微量清蛋白肌酐比值(ACR)。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)用[HOMA-IR=FINS×FBG/22.5]計(jì)算，F(xiàn)INS單位為mU/L，F(xiàn)BG單位為mmol/L。

1.3.2動脈血壓測定 各組大鼠動脈血壓測量采用無創(chuàng)大鼠鼠尾測壓儀。保持大鼠處于安靜清醒狀態(tài)，放置鼠尾于37 ℃加熱毯加熱，測量舒張壓(DBP)和收縮壓(SBP)。

1.3.3反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 腎臟總RNA的提取用Trizol，其水平和純度測定采用核酸蛋白儀。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增(試劑購自日本Takara公司)。PRMT1上游引物為：5′-GAG TTC ACC CGA TGC CAC AAG-3′，下游引物為：5′-TCC GGT AGT CGG TGG AAC AAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為238 bp，退火溫度為57 ℃。取產(chǎn)物加入2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后，采用BioRad GelDos200凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖片拍攝，光密度值采用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

1.3.4蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測PRMT1蛋白的表達(dá) 將腎臟組織加入蛋白裂解液中置于冰上勻漿，提取總蛋白，其蛋白水平測定采用BCA法。將蛋白樣品按常規(guī)方法加入配制好的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠中進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入PRMT1(1∶2 000，美國Cell Signaling公司)經(jīng)4 ℃孵育過夜后用磷酸鹽緩沖液洗膜，經(jīng)1 h室溫孵育二抗后再次洗膜，加入電化學(xué)發(fā)光試劑后采集圖像(BioRad 成像系統(tǒng))，分析光密度值(Quantity One軟件)。

1.3.5免疫組織化學(xué)法 常規(guī)脫蠟并進(jìn)行抗原熱修復(fù)，按說明書進(jìn)行一抗，在37 ℃下孵育2 h，經(jīng)4 ℃過夜后標(biāo)記二抗(用DAB顯色)，蘇木精復(fù)染、脫水并用中性樹脂封片，并于光鏡下觀察陽性細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算光密度值(Image-Pro Plus軟件)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠相關(guān)指標(biāo)比較 見表1、2。DM組大鼠FBG水平較NC組明顯升高，LM組與DM組比較明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與NC組比較，DM組及LM組大鼠體質(zhì)量、SBP、DBP、FINS、HOMA-IR、Cr、ACR及24 h mALB水平明顯升高，而LM組較DM組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2各組大鼠腎臟組織中PRMT1的mRNA表達(dá)比較 見圖1。與NC組比較，DM組及LM組大鼠腎臟組織中PRMT1的mRNA表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而LM組的表達(dá)較DM組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3各組大鼠腎臟組織中PRMT1蛋白表達(dá)比較 見圖2。與NC組比較，DM組及LM組大鼠腎臟組織中PRMT1蛋白表達(dá)明顯升高，而LM組的表達(dá)較DM組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4各組大鼠腎臟免疫組織化學(xué)法結(jié)果比較 見圖3。NC組大鼠腎小管上皮細(xì)胞核內(nèi)可見少量陽性細(xì)胞，DM組有大量陽性細(xì)胞，LM組也可見部分陽性細(xì)胞，介于NC組與DM組之間。NC組平均光密度值低于DM組及LM組，LM組光密度值低于DM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠生化指標(biāo)檢測結(jié)果比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05

表2 各組大鼠生理指標(biāo)檢測結(jié)果比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05

注：與NC組比較，*P<0.01；與LM組比較，△P<0.05

圖1大鼠腎臟組織中PRMT1的mRNA表達(dá)

注：與NC組比較，*P<0.01；與LM組比較，△P<0.05

圖2大鼠腎臟組織中PRMT1蛋白表達(dá)

注：與NC組比較，*P<0.01；與LM組比較，△P<0.05

圖3各組大鼠腎臟PRMT1蛋白表達(dá)免疫組織化學(xué)結(jié)果(HE，×400)

3 討 論

利格列汀屬于DPP4抑制劑，15%左右以原型經(jīng)腎臟排泄，85%左右經(jīng)糞便排出，故其不良反應(yīng)少，肝腎功能不全者無需調(diào)整劑量，在眾多DPP4抑制劑中有獨(dú)特優(yōu)勢。本研究以糖尿病SD大鼠模型作為研究對象，采用利格列汀干預(yù)治療12周，結(jié)果顯示該藥除明顯降糖作用外，還能降低其腎臟組織中PRMT1的表達(dá)，明顯減少24 h mALB及ACR，降低血Cr及血壓水平，提示利格列汀有腎臟保護(hù)作用，可能與下調(diào)腎臟組織中PRMT1的表達(dá)有關(guān)，推測其機(jī)制可能有以下幾方面。

3.1抑制氧化應(yīng)激 DPP4抑制劑對腎臟功能的保護(hù)作用機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)，相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，DPP4抑制劑能夠預(yù)防和改善心臟和腎臟組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)[6]。PRMT1-ADMA-DDAH1通路在糖尿病的氧化應(yīng)激中起重要作用。PRMT1的表達(dá)在糖尿病高氧化狀態(tài)下升高，而DDAH1的表達(dá)卻下降，導(dǎo)致ADMA水平升高。有研究發(fā)現(xiàn)，PRMT1-ADMA-DDAH1通路在糖尿病大鼠的多個(gè)器官，如胰腺、腎臟及眼中均表達(dá)失衡[3-5]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過利格列汀干預(yù)治療后，糖尿病大鼠腎臟組織中PRMT1 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低，證實(shí)了利格列汀對PRMT1-ADMA-DDAH1通路關(guān)鍵蛋白的調(diào)節(jié)作用，提示其具有抗氧化應(yīng)激效應(yīng)，與近期研究結(jié)果相似[7]。但本研究未對該軸其余2個(gè)分子的水平進(jìn)行檢測，后續(xù)研究可圍繞利格列汀作用于PRMT1相關(guān)通路展開進(jìn)一步研究。

3.2改善血流動力學(xué)和抑制血管增生 正常腎動脈呈高速低阻的血流動力學(xué)特點(diǎn)，隨著糖尿病病情進(jìn)展，受損血管內(nèi)皮細(xì)胞不斷增生，加重血管管腔的狹窄和閉塞。目前認(rèn)為，ADMA升高可能是糖尿病患者導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能失調(diào)的主要機(jī)制。DPP4抑制劑可抑制血管增生，改善血管內(nèi)膜與中膜比率及腎動脈血流動力學(xué)，抑制腎臟纖維化及血管內(nèi)皮增生，從而達(dá)到腎臟保護(hù)作用[8-9]。本研究顯示，通過利格列汀干預(yù)治療后，糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞核中PMRT1表達(dá)明顯降低，且SBP、Cr水平均下降。本研究推測這是由于利格列汀通過降低腎小管上皮細(xì)胞核中的PRMT1水平，抑制ADMA表達(dá)，從而減輕對血管內(nèi)皮功能的損傷，加上利格列汀對血壓的改善，減輕了DN狀態(tài)下高阻低速的血流動力學(xué)改變，從而降低Cr水平。本研究未檢測血流動力學(xué)及內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)指標(biāo)，這是本研究的不足之處。

3.3減輕胰島素抵抗及減少尿蛋白 早期研究發(fā)現(xiàn)，ADMA升高伴隨胰島素抵抗發(fā)生，而胰島素抵抗是糖尿病和高血壓的共同發(fā)病基礎(chǔ)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過利格列汀干預(yù)治療后，大鼠體質(zhì)量明顯下降，胰島素抵抗明顯改善，血糖得到較好控制。本研究推測，除DPP4抑制劑本身通過腸促胰島素途徑降低血糖外，利格列汀也可通過對PRMT1-ADMA-DDAH1軸的影響，改善胰島素抵抗，從而改善血糖水平。另外，DPP4抑制劑還有降低DN患者尿蛋白及改善腎臟功能的作用[11]。本研究結(jié)果提示，利格列汀單藥治療12周后可明顯減少糖尿病大鼠24 h mALB、ACR及血Cr水平。作者推測，血糖降低本身可從一定程度上改善腎功能和蛋白尿，但利格列汀除降糖機(jī)制的降尿蛋白作用外，還對腎功能起到一定保護(hù)作用。

綜上所述，利格列汀可以通過對糖尿病大鼠腎臟中PRMT1表達(dá)的影響，起到改善氧化應(yīng)激、抑制血管增生、改善腎臟血流動力學(xué)、緩解胰島素抵抗和減少尿蛋白等作用，在一定程度上延緩和改善了DN的發(fā)生和發(fā)展。