謝 祺，張 米，雷素云，高 麗，張桂仙，楊?；?，董興齊

(云南省傳染病?？漆t(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650301)

全球人類免疫缺陷病毒合并結(jié)核分枝桿菌(HIV/MTB)感染的病例逐年增多，每年增幅近10%[1]。2016年全世界1 040萬新發(fā)結(jié)核病患者中估計(jì)有103萬(9.9%)為HIV感染者，其中死于HIV相關(guān)結(jié)核病的人數(shù)達(dá)37.4萬。在HIV感染者中結(jié)核病控制面臨的最大問題是無法準(zhǔn)確、快速地診斷出結(jié)核病患者[2]。故HIV/MTB感染給艾滋病及結(jié)核病的預(yù)防和治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)，也成為全球極其緊迫的公共衛(wèi)生問題。耐多藥結(jié)核病發(fā)現(xiàn)和治療危機(jī)仍然嚴(yán)重，2016年共新發(fā)1 040萬結(jié)核病，其中新發(fā)耐多藥結(jié)核病病例估計(jì)有49萬，其中只有近13萬登記接受診療；2013年，全球耐多藥結(jié)核病治療成功率為52%[2]。此外，HIV/MTB感染者的診治有其特殊性，涉及抗結(jié)核和抗-HIV治療2個(gè)方面，藥物不良反應(yīng)、服藥依從性、藥物間相互作用均會(huì)影響治療效果，HIV感染者結(jié)核病的治療成功率也相對(duì)較低[3]。MTB耐藥性監(jiān)測對(duì)HIV/MTB感染者極為重要。利福平(RFP)和異煙肼(INH)是結(jié)核病治療中最重要的兩種一線藥物，結(jié)核病患者如果對(duì)這兩種藥物產(chǎn)生耐藥將給治療帶來極大的困難。了解RFP及INH耐藥株相關(guān)耐藥基因突變特征，對(duì)揭示MTB耐藥機(jī)制，實(shí)現(xiàn)對(duì)耐藥MTB的快速檢測有重要意義。本研究采用基因芯片技術(shù)對(duì)云南省208例HIV/MTB感染者標(biāo)本進(jìn)行MTB耐RFP基因RNA聚合酶β亞單位編碼基因(rpoB)，耐INH基因過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因(katG)、烯?；€原酶編碼基因(inhA)的常見突變位點(diǎn)檢測，以了解云南省HIV/MTB感染者M(jìn)TB耐RFP基因rpoB、耐INH基因katG、inhA突變頻率和突變特征，以期闡明云南省HIV/MTB感染者M(jìn)TB對(duì)RFP和INH的耐藥機(jī)制及分子基礎(chǔ)，為HIV/MTB感染者M(jìn)TB耐藥的快速診斷和篩選提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年9月至2017年12月本院感染科收治的HIV/MTB感染者208例，其中男144例，女64例，年齡17～83歲，平均(39.9±12.7)歲。所有患者HIV感染的診斷均符合原國家衛(wèi)生部2008年頒布的《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標(biāo)準(zhǔn)》，所有患者標(biāo)本抗酸染色或分枝桿菌培養(yǎng)陽性且經(jīng)基因芯片技術(shù)菌種鑒定證實(shí)為MTB。208例標(biāo)本中痰液152例，膿液20例，灌洗液15例，胸腔積液13例，腹水4例，糞便4例。

1.2儀器與試劑 采用北京博奧生物有限公司生產(chǎn)的MTB耐藥基因芯片檢測試劑及LuxScan10K-B微陣列芯片掃描儀等配套儀器進(jìn)行檢測。

1.3方法 MTB耐藥基因檢測包括兩種一線藥物(RFP及INH)的3種耐藥相關(guān)基因(rpoB、katG及inhA)啟動(dòng)子的野生型及不同變異型。對(duì)于RFP耐藥相關(guān)基因rpoB檢測6個(gè)位點(diǎn)，包括531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位CAA→AAA、516位GAC→GTC、516位GAC→TAC、516位GAC→GGC、533位CTG→CCG等13種突變型；對(duì)于INH耐藥相關(guān)基因katG及inhA基因啟動(dòng)子各檢測1個(gè)位點(diǎn)，分別為katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC 2個(gè)突變型，inhA基因啟動(dòng)子15位C→T突變型。檢測探針和對(duì)照探針各重復(fù)5個(gè)點(diǎn)，每行1～5和6～10分別為同一探針，RFP相關(guān)rpoB基因的探針排列示意見表1，INH相關(guān)katG基因和inhA基因的探針排列示意見表2。

表1 RFP相關(guān)rpoB基因的探針排列

注：QC為表面化學(xué)質(zhì)控探針；EC為雜交陽性外對(duì)照探針；BC為空白對(duì)照；NC為陰性對(duì)照探針；IC為內(nèi)對(duì)照探針；WT為野生型

表2 INH相關(guān)katG基因和inhA基因的探針排列

注：QC為表面化學(xué)質(zhì)控探針；EC為雜交陽性外對(duì)照探針；BC為空白對(duì)照；NC為陰性對(duì)照探針；IC為內(nèi)對(duì)照探針；WT為野生型

1.3.1標(biāo)本制備 取患者標(biāo)本加入離心管中，95 ℃水浴30 min滅活處理后加等體積N-乙酰-L半胱氨酸-氫氧化鈉對(duì)標(biāo)本進(jìn)行液化處理，取1 mL液化標(biāo)本加入離心管高速離心后去上清液備用。將處理好的標(biāo)本放入晶芯ExtractorTM 36核酸快速提取儀中提取核酸，再將提取到的核酸加入到基因擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，并將得到的核酸置于-20 ℃保存。

1.3.2芯片雜交 取雜交緩沖液9 μL、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物6 μL，混勻，95 ℃熱浴5 min，變性，在冰水混合物中驟冷3 min。取13.5 μL雜交溶液加入芯片，置雜交儀，50 ℃雜交2 h后置洗干儀內(nèi)洗滌甩干。

1.3.3掃描判讀 將芯片插入芯片掃描儀內(nèi)，運(yùn)行芯片掃描和結(jié)果判讀。

2 結(jié) 果

2.1RFP和INH總體耐藥情況 208例標(biāo)本中共發(fā)現(xiàn)34例(16.3%)耐藥，其中單耐RFP 6例(2.9%)，單耐INH 10例(4.8%)，二者同時(shí)耐藥18例(8.7%)。

2.224例MTB對(duì)RFP耐藥相關(guān)基因rpoB的突變特征 見表3。208例標(biāo)本中共發(fā)現(xiàn)24例RFP耐藥基因rpoB發(fā)生突變，總突變率為11.5%，其中單位點(diǎn)突變23例(95.8%)，突變形式主要為rpoB531TCG→TTG；雙位點(diǎn)突變1例(4.2%)，突變形式為rpoB511CTG→CCG加rpoB516GAC→TAC。

表3 24例MTB對(duì)RFP耐藥相關(guān)基因rpoB的突變特征

2.328例MTB對(duì)INH耐藥相關(guān)基因katG和inhA的突變特征 見表4。在208例標(biāo)本中共發(fā)現(xiàn)28例INH耐藥基因katG和inhA發(fā)生突變，總突變率為13.5%，其中katG突變及缺失26例，突變形式主要為katG315 AGC→ACC；inhA突變2例，突變形式為inhA-15C→T。

表4 28例MTB對(duì)INH耐藥相關(guān)基因katG和inhA的突變特征

3 討 論

RFP與INH是應(yīng)用最廣泛的一線抗結(jié)核藥物，二者組合能取得較好的療效，但由于長期治療不當(dāng)，包括治療方案不當(dāng)、劑量不足、患者依從性差等原因，RFP與INH耐藥率呈上升趨勢(shì)，這也是TB在全球再次暴發(fā)難以控制的主要原因之一。MTB的耐藥性是相關(guān)基因突變引起的，故對(duì)RFP和INH的耐藥性進(jìn)行檢測對(duì)臨床治療結(jié)核有積極意義[4]。

傳統(tǒng)的MTB藥敏試驗(yàn)陽性率低、培養(yǎng)周期長，給臨床上HIV/MTB感染者的診斷和治療帶來了極大的困難。基因芯片是近幾年在醫(yī)療領(lǐng)域最具影響力的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，可通過檢測耐藥突變基因的存在與否協(xié)助判斷MTB的耐藥情況。國內(nèi)多中心驗(yàn)證結(jié)果表明，基因芯片技術(shù)檢測RFP、INH耐藥性，其敏感度分別為87.56%、80.34%，特異度分別為97.95%、95.82%[5]?；蛐酒夹g(shù)適宜多種類型標(biāo)本的檢測，檢測時(shí)間較傳統(tǒng)方法明顯快速，從而做到及早診斷、及時(shí)選擇敏感藥物，及時(shí)控制結(jié)核病疫情。

多項(xiàng)研究結(jié)果表明，HIV/MTB感染者對(duì)抗結(jié)核藥物的耐藥性以耐RFP和INH最為突出。王印等[6]報(bào)道，成都地區(qū)196例HIV合并MTB雙重感染者M(jìn)TB總耐藥率為26.02%，其中INH和RFP在4種一線抗結(jié)核藥中耐藥率最高，分別為21.94%和16.33%；汪亞玲等[7]對(duì)25例HIV合并MTB陽性病例進(jìn)行耐藥性分析發(fā)現(xiàn)其耐藥率為16.00%。本研究中MTB總耐藥率為16.30%，與上述報(bào)道略有差異，這可能與研究方法不一致、不同地域傳染流行不太一致有關(guān)。

RFP通過與RNA聚合酶β亞單位結(jié)合，干擾、抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而達(dá)到殺菌的效果，rpoB基因突變使RNA聚合酶高度保守的氨基酸發(fā)生置換，進(jìn)而阻止RFP的結(jié)合而導(dǎo)致耐藥。在MTB耐RFP分離株中，90%以上在所分析的rpoB基因不同部位存在多種突變，突變一般發(fā)生在rpoB 507～533位27個(gè)氨基酸密碼子(81 bp)組成的RFP耐藥決定區(qū)(RRDR)內(nèi)。其中最常見的突變位點(diǎn)是531位的絲氨酸(Ser)(40%～60%)、526位的組氨酸(His)(30%～36%)、516位的天冬氨酸(Asp)(7%～9%)[8]。rpoB基因突變特征具有明顯的地域性差異，不同國家和地區(qū)RFP耐藥MTB的rpoB基因變異譜和變異率呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn)，這可能與rpoB特定位點(diǎn)突變致耐RFP菌種在某一特定地域傳染流行有關(guān)，也可能與研究標(biāo)本量少和抽樣方法不一致有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，云南省HIV/MTB感染人群中RFP耐藥MTB的rpoB基因突變以RRDR-531(TCG→TTG，Ser→Leu)為主(66.7%)。國內(nèi)外研究結(jié)果表明，531位密碼子突變一般導(dǎo)致高水平耐藥，與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)有較好的一致性，該突變作為RFP耐藥MTB診斷的分子標(biāo)記靶點(diǎn)有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

MTB對(duì)INH的耐藥機(jī)制與katG、inhA和ahpC基因的啟動(dòng)子缺失或突變有關(guān)，其中katG完全缺失或點(diǎn)突變是最主要的耐藥機(jī)制[9]。katG基因變異會(huì)導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物過氧化氫-過氧化物酶的活性喪失或降低，使INH不能活化，從而不能攻擊分枝菌酸，導(dǎo)致MTB對(duì)INH耐藥[10]。inhA啟動(dòng)子變異會(huì)增強(qiáng)烯?；阴］d體蛋白還原酶的表達(dá)，超過了藥物抑制作用，從而使菌株耐受INH[11]。katG基因中常見的突變率位點(diǎn)是315位(AGC→ACC，Ser→Thr)，發(fā)生率約為60.00%[8]。本研究中云南省HIV/MTB感染人群中INH耐藥MTB的katG基因突變以315位(AGC→ACC，Ser→Thr)為主(78.6%)，較60.00%略高，這可能與檢測人群不一致、不同地區(qū)菌株耐藥相關(guān)基因變異存在多態(tài)性，突變類型、位點(diǎn)、頻率各不相同有關(guān)。本研究中還檢出1例katG基因完全缺失，在MTB耐INH分離株中，有2%～10%的分離株發(fā)生katG基因完全缺失，而且主要出現(xiàn)在高度耐INH菌株中，故katG基因缺失對(duì)MTB耐INH有較好的指導(dǎo)意義。在MTB耐INH分離株中，10%～35%的分離株在inhA啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生突變，最常見的突變位點(diǎn)是15位[8]。本研究中僅有2株耐藥菌檢出15位突變，原因可能是該基因耐藥株不是云南省HIV/MTB人群中流行的優(yōu)勢(shì)耐藥菌株，或者此基因變異率不高，但尚需擴(kuò)大標(biāo)本量進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究闡明了云南省HIV/MTB感染者中MTB耐RFP rpoB基因的主要突變位點(diǎn)為531(TCG→TTG)，耐INH katG、inhA基因的主要突變位點(diǎn)為katG基因315(AGC→ACC)，其作為耐多藥結(jié)核診斷的分子標(biāo)記靶點(diǎn)有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。