毛 凌， 賈蟬憶， 賀 滟， 韓 勇

(遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室， 貴州 遵義 563000)

花生四烯酸(arachidonic acid，AA)可通過環(huán)氧合酶和脂氧合酶代謝途徑生成白三烯類、前列腺素類和血栓素類等物質(zhì)[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，AA經(jīng)過細(xì)胞色素P450(cytochrome P450, CYP)代謝途徑中的表氧化酶作用可生成環(huán)氧二十碳四烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EETs)，經(jīng)過羥化酶作用生成羥基二十碳四烯酸(hydroxyeicosatetraeonic acids, HETEs)，如20-羥基二十碳四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE)。20-HETE作為AA的重要代謝產(chǎn)物，與高血壓、腦卒中、心肌梗死、血管痙攣和血管再狹窄等疾病密切相關(guān)[2-4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)20-HETE的結(jié)構(gòu)類似物可阻斷或模擬20-HETE所誘導(dǎo)的縮血管效應(yīng)[5]，提示在細(xì)胞中存在一種特異性結(jié)合位點來調(diào)節(jié)20-HETE的作用，但由于20-HETE比其它脂類活性物質(zhì)具有更大的脂溶性特性，會被細(xì)胞迅速攝取并由膜磷脂所酯化，因此探究20-HETE是否與細(xì)胞膜綁定的G蛋白或其它類型受體結(jié)合進而發(fā)揮生理作用的研究進展緩慢。

最近，Garcia等[6]學(xué)者通過點擊化學(xué)交聯(lián)、伴侶蛋白分析和受體結(jié)合分析等研究方法首次發(fā)現(xiàn)，20-HETE可通過G蛋白偶聯(lián)受體75(G-protein-coupled receptor 75, GPR75)影響血管功能并引發(fā)高血壓。GPR75屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptor,GPCRs)家族中視紫紅質(zhì)樣受體，被學(xué)者列為孤兒GPCRs[7]，并進行了多項研究以確定其配體。在一項研究中發(fā)現(xiàn)，在胰島β細(xì)胞中表達(dá)GPR75并通過CC類趨化因子配體5(C-C motif chemokine ligand 5, CCL5)刺激胰島素合成，但是該研究并未鑒定CCL5和GPR75之間的直接結(jié)合或相互作用[8]。20-HETE-GPR75功能聯(lián)系的發(fā)現(xiàn)，對于揭示20-HETE生物學(xué)作用相關(guān)分子機制研究具有重要意義。

1 20-HETE作用受體的研究

有學(xué)者首先發(fā)現(xiàn)20-HETE的一些特異性的結(jié)構(gòu)類似物或拮抗劑可模擬或阻斷其生物作用，提示細(xì)胞中存在與20-HETE特異性結(jié)合的位點[5]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，20-HETE可通過磷脂酶C(phospholipase C, PLC)/蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)途徑依賴機制發(fā)揮血管收縮效應(yīng)及鈉尿排泄作用，由其誘發(fā)的細(xì)胞遷移和增殖以及內(nèi)皮功能紊亂和炎癥反應(yīng)的作用與表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor, EGFR)磷酸化、c-Src和促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信號通路激活密切相關(guān)[9]，而EGFR、c-Src和MAPK信號通路是GPCRs的下游作用靶點。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在腎臟上皮細(xì)胞中，20-HETE可通過EGFR和c-Src依賴機制激活Raf/MEK/ERK途徑[10]。這些研究進一步提示細(xì)胞內(nèi)可能存在通過c-Src介導(dǎo)的20-HETE特異性GPCRs-EGFR的轉(zhuǎn)激活現(xiàn)象，即非配體依賴途徑激活GPCRs。但20-HETE化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，作為脂質(zhì)類物質(zhì)可直接透膜進入細(xì)胞，并被迅速酯化為磷脂或與相應(yīng)膜蛋白結(jié)合，從而在細(xì)胞內(nèi)進行分布，這為鑒定20-HETE在細(xì)胞內(nèi)的綁定效應(yīng)物提出了較高要求。Garcia等[6]應(yīng)用了具有光敏特性的20-HETE類似物(20-ApheDa)，利用點擊化學(xué)方法將20-HETE類似物附著熒光標(biāo)簽，并使之分布到細(xì)胞表面附近，隨后通過被標(biāo)記的20-HETE類似物，利用蛋白組學(xué)等技術(shù)鑒定出與之結(jié)合的配體，最終發(fā)現(xiàn)20-HETE類似物結(jié)合的膜蛋白——GPR75蛋白。由于20-HETE在高血壓、腦卒中、心肌梗死、血管壁肥厚、腎缺血/再灌注損傷、血管再生、細(xì)胞增殖和腫瘤等疾病的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用[11]，GPR75的鑒定是深入探究20-HETE在心血管疾病中作用機制的重要發(fā)現(xiàn)，為其它脂類活性物質(zhì)受體的發(fā)現(xiàn)提供新方法，為研制治療心血管疾病藥物提供新的靶向目標(biāo)和新的思路。

2 20-HETE-GPR75與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂

血管內(nèi)皮功能紊亂是高血壓等心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病、糖尿病以及腫瘤性疾病的誘發(fā)因素，內(nèi)皮功能障礙主要誘因與NO的生物利用度降低密切相關(guān)[12-13]。雖然血管內(nèi)皮細(xì)胞不是20-HETE生成的主要部位，但研究表明20-HETE通過與NO的相互作用，在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能方面發(fā)揮重要作用[14],一方面，在NO的非cGMP依賴作用途徑中，NO可與CYP ω-羥化酶家族CYP1B、CYP2C和CYP4A結(jié)合，通過減少20-HETE合成，從而降低對大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large-conductance calcium-activated potassium channel, BKCa)的抑制效應(yīng)，有效減弱20-HETE介導(dǎo)的血管收縮效應(yīng)[15];另一方面，20-HETE可通過核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信號通路介導(dǎo)，引起內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)解偶聯(lián)而阻礙NO生成，導(dǎo)致其生物利用率降低[16]。20-HETE所引起的內(nèi)皮功能紊亂在高血壓相關(guān)的疾病中發(fā)揮重要作用，最近一項研究發(fā)現(xiàn)，20-HETE通過增強嗜中性粒細(xì)胞浸潤作用而誘發(fā)內(nèi)皮功能障礙和凋亡，加重代謝綜合征大鼠的高血壓發(fā)展[17]。

Garcia等[6]報道，20-HETE通過降低NO利用率促進血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂與GPR75受體的激活密切相關(guān)。在該項研究中發(fā)現(xiàn)，20-HETE首先與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的GPR75綁定，進而激活該受體，活化的GPR75一方面與其綁定單位Gαq/11解離，分離的Gαq/11激活PLC，活化的PLC進而水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate, PIP2)生成肌醇三磷酸(inositol trisphosphate, IP3)和二酰甘油(diacylglycerol, DAG)，而IP3具有促使PKC的磷酸化、激活和易位等作用[18];另一方面，GPR75被激活后促進與其結(jié)合的GPCR激酶2相互作用蛋白1(GPCR kinase 2-interacting protein 1, GIT1)釋放c-Src，c-Src與EGFR結(jié)合并使之磷酸化，后者通過激活NF-κB信號通路最終引發(fā)內(nèi)皮eNOS的解聚、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)的表達(dá)，ACE激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)導(dǎo)致血管緊張素II(angiotensin II, Ang II)升高，Ang II有促進內(nèi)皮素生成、刺激超氧負(fù)離子生成的功能，進一步干擾NO的生成及生物利用度，達(dá)到收縮血管的作用，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂[19]?？傊?，如上研究表明GPR75-20-HETE是引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，進而誘發(fā)血管炎癥、損傷以及高血壓等疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。20-HETE-GPR75誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑見圖1。

3 20-HETE-GPR75調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞功能

大量研究證實，20-HETE具有強效的收縮血管平滑肌的作用，通過對血管緊張度的調(diào)節(jié)引起外周血管收縮，從而參與高血壓的發(fā)生和發(fā)展[4, 11]。目前研究認(rèn)為其作用機制主要包括：(1)20-HETE通過抑制平滑肌細(xì)胞膜上BKCa的開放減少K+外流，細(xì)胞膜發(fā)生去極化，激活電壓門控L型Ca2+通道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高,觸發(fā)興奮-收縮偶聯(lián)，使血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生收縮；(2)直接作用于細(xì)胞膜L型Ca2+通道增加Ca2+內(nèi)流，提高細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度；(3)激活Rho相關(guān)激酶(Rho-associated kinase, ROCK)增加平滑肌細(xì)胞對Ca2+敏感性。

在培養(yǎng)的大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞中，Garcia等[6]同樣鑒定出20-HETE與GPR75的綁定，通過GPR75介導(dǎo)20-HETE對血管緊張度的調(diào)節(jié)作用。20-HETE首先與平滑肌細(xì)胞膜表面GPR75結(jié)合并使其激活，活化的GPR75與Gαq/11亞單位解離，Gαq/11通過激活PLC生成IP3，IP3通過PKC的磷酸化途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3受體通道增加細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平從而引發(fā)血管收縮。該研究還發(fā)現(xiàn)，GPR75-20-HETE可通過平滑肌細(xì)胞中PKCα激活和c-Src釋放機制磷酸化BKCa的β亞單位從而抑制該通道，降低平滑肌細(xì)胞膜電位使L型Ca2+通道激活，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。此外，20-HETE通過GPR75激活細(xì)胞內(nèi)的PKC磷酸化，除引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高增強平滑肌細(xì)胞收縮，還可激活ROCK信號通路，通過ROCK磷酸化增加肌球蛋白輕鏈磷酸化作用，提高平滑肌細(xì)胞對Ca2+敏感性，促進平滑肌細(xì)胞收縮[20]。20-HETE-GPR75促進平滑肌細(xì)胞收縮的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑見圖2。

4 20-HETE對高血壓的影響及GPR75的作用

大量動物及人體研究實驗表明，在不同類型的高血壓中20-HETE的含量發(fā)生改變，減少20-HETE生成或阻斷其作用可起到有效降低血壓的作用[4, 11]。如在自發(fā)高血壓模型大鼠中，抑制CYP4A、減少20-HETE生成可降低血管炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及改善血管的舒縮功能[21]；在高鹽誘導(dǎo)大鼠高血壓中，阻斷20-HETE生成可降低高鹽誘導(dǎo)的血壓升高作用[22]；在過表達(dá)人CYP4A11的轉(zhuǎn)基因小鼠中，腎臟及尿液中20-HETE生成增加，同時伴有血壓升高，而低鹽飲食以及抑制20-HETE合成可有效降低血壓[23]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，20-HETE水平增高參與了雄激素誘導(dǎo)的高血壓發(fā)展，抑制CYP4A2及20-HETE作用可有效降低雄激素誘導(dǎo)的血壓升高，介導(dǎo)絕經(jīng)后婦女及多囊卵巢綜合征患者高血壓進程，該種類型高血壓也被學(xué)者稱為雄激素誘導(dǎo)20-HETE依賴性高血壓[24]。此外，20-HETE與RAS在高血壓發(fā)病機制方面存在復(fù)雜的交互作用。一方面，RAS中重要組成部分——Ang II可通過血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin II type 1 receptor, AT1)途徑促進20-HETE生成，阻斷20-HETE的合成可抑制Ang II依賴性高血壓的發(fā)展[25];而另一方面，深入研究發(fā)現(xiàn)20-HETE又是促進內(nèi)皮細(xì)胞ACE表達(dá)的誘導(dǎo)劑和轉(zhuǎn)錄激活因子，通過ACE誘導(dǎo)激活RAS[26]?？傊?0-HETE除直接作用于血管內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞導(dǎo)致血管功能障礙誘發(fā)高血壓，還可參與多種誘發(fā)因素以及體內(nèi)活性物質(zhì)，如雄激素和Ang II依賴性高血壓的發(fā)生、發(fā)展。

如前所述，20-HETE通過激活GPR75機制導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞NO生物利用度降低，誘發(fā)內(nèi)皮功能紊亂；另一方面，20-HETE-GPR75還可通過激活PKC途徑以及抑制BKCa等機制誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增高、增加血管緊張度，如上作用是20-HETE參與高血壓發(fā)生發(fā)展的重要機制。Garcia等[6]在CYP4A12轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)的20-HETE依賴性高血壓中研究證實，GPR75激活是20-HETE促高血壓反應(yīng)的必要條件。該研究中發(fā)現(xiàn)，敲除GPR75有效降低了多西環(huán)素處理的CYP4A12轉(zhuǎn)基因小鼠血壓升高效應(yīng)，同時在敲除GPR75后，血管中20-HETE誘導(dǎo)的ACE表達(dá)水平顯著降低，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，并減少血管平滑肌對于腎上腺素的收縮反應(yīng)，阻斷了20-HETE誘導(dǎo)的腎臟微血管管壁厚度和直徑的增加?？傊?，在20-HETE依賴性高血壓中，20-HETE誘導(dǎo)的平滑肌緊張度增高、血管內(nèi)皮功能紊亂以及血管重塑等作用，依賴于GPR75的激活，敲除GPR75的表達(dá)發(fā)揮類似20-HETE抑制劑的同樣作用，提示GPR75可能是治療高血壓的可行靶點，這也是首次發(fā)現(xiàn)GPR75在高血壓的發(fā)病中發(fā)揮作用。

Figure 2.The signaling pathways of 20-HETE-GPR75 pairing-induced contraction of vascular smooth muscle cells (VSMCs). 20-HETE binds to GPR75 and functionally activates the receptor in VSMCs. This leads to elevate cytosolic Ca2+ level via mechanisms that include activation of Ca2+ channel in the membrane, IP3 receptor-gated Ca2+ channel, and inhibition of the BKCa channels though dissociation of the Gαq/11 subunit and release of c-Src from GIT1, as well as maintain the phosphorylated state of myosin light chain which further sensitizes the VSMCs to Ca2+ by Rho-associated kinase, all of which can stimulate VSMC contraction, leading to the development of hypertension. VGCC: voltage-gated calcium channel; BKCa: large-conductance calcium-activated potassium channel; GIT1: GPCR kinase 2-interacting protein 1; HIC-5: hydrogen peroxide-inducible clone 5 protein; PIP2: phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate; IP3: inositol trisphosphate; DAG: diacylglycerol; PKC: protein kinase C; ROCK: Rho-associated kinase; MLCK: myosin light chain kinase.

5 問題與展望

在心血管系統(tǒng)中，20-HETE是一種強效的血管收縮劑，其水平的升高會促進高血壓、腦卒中、心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展[4]。因此，GPR75受體的發(fā)現(xiàn)為深入了解20-HETE調(diào)控血壓、參與心血管疾病機制提供了新思路，但該發(fā)現(xiàn)也為深入研究提出了諸多問題與挑戰(zhàn)。首要問題是確定GPR75是否在20-HETE發(fā)揮作用的所有組織中表達(dá)并介導(dǎo)其生物學(xué)效應(yīng)？在人體及動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)，CYP4A在腎臟中的近端小管、髓袢以及腎血管系統(tǒng)中高表達(dá)，是合成20-HETE重要部位，通過鈉尿排泄調(diào)節(jié)參與血壓的調(diào)節(jié)[27]。然而，Garcia等[6]的研究表明，GPR75的mRNA和蛋白在腎臟中的表達(dá)相對較低。因此，很有必要深入研究確定GPR75是否介導(dǎo)了20-HETE在腎臟的鈉尿排泄作用。此外，近年研究發(fā)現(xiàn)CYP4A和CYP4F在心臟組織中表達(dá)，在心肌缺血再灌注損傷進程中20-HETE含量增高，抑制其合成可改善再灌注后心肌功能恢復(fù)和減少梗死面積發(fā)生[28-29]。筆者所在實驗室研究發(fā)現(xiàn)，20-HETE具有顯著的促進心肌細(xì)胞凋亡和肥大的作用[30-32]，可能是20-HETE參與相關(guān)缺血性心臟疾病的重要機制。然而，目前仍尚缺乏GPR75在心臟組織中表達(dá)以及相關(guān)生物學(xué)作用的研究報道。

總之，20-HETE在機體內(nèi)多種組織器官中生成并發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)，如在腦組織、肺臟、肝臟、心臟、血管平滑肌、中性粒細(xì)胞、血小板等[3-4, 9, 11]，而目前為止，針對GPR75在機體內(nèi)的表達(dá)及其功能的研究非常有限，根據(jù)Gene Card等數(shù)據(jù)庫公布，GPR75僅在腦和脊髓中mRNA以高水平表達(dá)，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞以及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中可檢測mRNA水平表達(dá)，在胰島β細(xì)胞中蛋白水平表達(dá)[8]。由于GPR75目前仍被列為孤兒受體[7]，其生物學(xué)作用一直未被闡明，20-HETE-GPR75配對機制研究的發(fā)現(xiàn)，一方面為揭示20-HETE生物學(xué)作用的分子機制提供了新思路，另一方面由于GPR75介導(dǎo)20-HETE血管升壓效應(yīng)，為進一步探究GPR75功能的研究開辟了重要領(lǐng)域。