向 萊， 江 濤

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 重慶 400016)

肺纖維化是一種常見(jiàn)的，以成纖維細(xì)胞(fibroblast，F(xiàn)B)大量異常增殖、轉(zhuǎn)化及分泌并沉積大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)為特征的肺間質(zhì)疾病的病理過(guò)程。眾所周知，肺間質(zhì)疾病的病程呈進(jìn)行性發(fā)展，最終絕大多數(shù)病人因呼吸功能衰竭而死亡。大部分肺纖維化患者確診后，生存期僅2～5年[1-4]。程序性細(xì)胞死亡蛋白4(programmed cell death protein 4，PDCD4)是一種抑癌基因，有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，研究發(fā)現(xiàn)PDCD4在肝纖維化和心肌纖維化中呈低表達(dá)[5-6]，然而，PDCD4是否參了肺纖維化的發(fā)生發(fā)展目前還不清楚。FB可以異常增殖轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MB)，MB可大量分泌ECM，其分泌功能是FB的數(shù)倍，MB不僅與ECM的分泌有關(guān)，與ECM的降解也有關(guān)[7-10]。在肺纖維化患者和通過(guò)博來(lái)霉素建立的肺纖維化模型中都發(fā)現(xiàn)了MB的異常增殖[9, 11-13]。MB是肺纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，其與FB的主要區(qū)別在于是否明顯表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，因此α-SMA蛋白可以作為MB的標(biāo)志物。羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)是膠原組織代謝的重要指標(biāo)，可以間接反映肺纖維化的程度。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1， TGF-β1)被證明在體外及體內(nèi)均可誘導(dǎo)FB轉(zhuǎn)分化為MB[14-15]，并刺激ECM的產(chǎn)生[16]，故TGF-β1廣泛用于體外肺纖維化模型的誘導(dǎo)建立。本實(shí)驗(yàn)計(jì)劃在體外給予TGF-β1誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞系HFL-1增殖轉(zhuǎn)化為MB，從而建立肺纖維化細(xì)胞模型；并在體內(nèi)使用博來(lái)霉素建立小鼠肺纖維化模型，進(jìn)而研究PDCD4 在肺纖維化中的表達(dá)情況及其對(duì)MB生長(zhǎng)的影響及可能的調(diào)控機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料及主要試劑

人胚肺成纖維細(xì)胞HFL-1購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清和胰酶均購(gòu)自HyClone；重組人TGF-β1購(gòu)自PeproTech；注射用鹽酸博來(lái)霉素購(gòu)自海正輝瑞；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol總RNA提取試劑及熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa；所有PCR引物均購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)抑制劑LY294002和LipofectamineTM6000購(gòu)自碧云天公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega；質(zhì)粒pEZ-M03-PDCD4和pEZ-M03由Gene CopoeiaTM合成；CCK-8 試劑盒購(gòu)自同仁試劑公司；羥脯氨酸試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗人α-SMA、p-AKT、AKT、c-Myc和細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)單克隆抗體及抗I型膠原(collagen type I，COL-I)多克隆抗體購(gòu)自Abcam；兔抗人PDCD4 單克隆抗體購(gòu)自CST；HRP標(biāo)記的抗兔和抗鼠IgG和鼠抗人GAPDH抗體均購(gòu)自碧云天生物公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) HFL-1細(xì)胞接種于含1%青霉素-鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并培養(yǎng)于5% CO2、飽和濕度和37 ℃恒定溫度培養(yǎng)箱。

2.2RT-qPCR法測(cè)定PDCD4、α-SMA和COL-I的mRNA表達(dá) 正常HFL1細(xì)胞和10 μg/L TGF-β1處理HFL1細(xì)胞4 h后，用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，全自動(dòng)熒光定量 PCR儀擴(kuò)增并進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。PDCD4的上游引物序列為5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’，下游引物序列為5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為673 bp；α-SMA的上游引物序列為5’-GCGTGGCTATTCCTTCGTTAC-3’，下游引物序列為5’-CATAGTGGTGCCCCCTGATAG-3’， 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為373 bp；COL-I的上游引物序列為5’-TGGTGACAAGGGTGAGA -3’，下游引物序列為5’-GGATGTTCTCGATCTGCTGG-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為458 bp；GAPDH的上游引物序列為5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物序列為5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC -3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為258 bp。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃變性 15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸 30 s，循環(huán)40次。結(jié)果采用2-ΔΔCt法，計(jì)算 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.3Western blot法測(cè)定PDCD4、α-SMA和COL-I的蛋白表達(dá) 分別對(duì)正常HFL1細(xì)胞和用10 μg/L TGF-β1處理4 h后的HFL1細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白濃度，將上樣緩沖液與蛋白樣品按照1∶4的體積比例混勻，在100 ℃變性。按每孔30 mg的體系電泳、轉(zhuǎn)膜。所得條帶經(jīng)5% BSA封閉60 min，4 ℃環(huán)境下放置在對(duì)應(yīng)的I抗處理8 h，TBST清洗3遍，每次5 min；分別加入對(duì)應(yīng)的II抗室溫孵育1 h，TBST清洗3遍，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用E.Z.N.A.TMEndo-Free Plasmid Mini Kit II質(zhì)粒提取試劑盒提取pEZ-M03-PDCD4及pEZ-M03空質(zhì)粒 (按說(shuō)明書操作)。轉(zhuǎn)染前12 h按 2.0×108/L細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，于5% CO2、37 ℃細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)8 h。待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)，將3.5 μg質(zhì)粒和5 μL LipofectamineTM6000混合后，轉(zhuǎn)染進(jìn)10 μg/L TGF-β1處理48 h后的HFL1細(xì)胞，使用無(wú)血清培養(yǎng)基(按說(shuō)明書操作)。轉(zhuǎn)染6 h后換完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照(blank control)組、pEZ-M03-PDCD4組和pEZ-M03組。

2.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取空白對(duì)照組、pEZ-M03-PDCD4轉(zhuǎn)染組和pEZ-M03對(duì)照組細(xì)胞，每組設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔，分別將空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TGF-β1處理的HFL-1細(xì)胞接種于96孔板，每孔約 4×103個(gè)細(xì)胞，于種板后 24、48和72 h分別在每孔中加入10 μL CCK-8，置于細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)1 h；酶標(biāo)儀讀取450 nm波長(zhǎng)處的A值。

2.6羥脯氨酸消化法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HYP的含量 分別取HLF-1細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞及轉(zhuǎn)染48 h后的肌成纖維細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。上清液HYP (mg/L)=(測(cè)定管A值-空白管A值) /(標(biāo)準(zhǔn)管A值-空白管A值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

2.7動(dòng)物模型的建立及樣本采集 取8只C57雄性小鼠，隨機(jī)分為2組(n=4)：模型(model)組和對(duì)照(control)組，小鼠經(jīng)水合氯醛(4%)麻醉后，手術(shù)暴露氣管，向模型組氣管內(nèi)注入0.2 mL(3 mg/kg)博來(lái)霉素生理鹽水溶液，向?qū)φ战M氣管內(nèi)注入等量生理鹽水，立即直立小鼠，并輕晃小鼠使藥物均勻分布于肺，繼續(xù)飼養(yǎng)21 d后處死小鼠，取出肺組織，右肺組織保存于-80 ℃冰箱保存，用于PDCD4蛋白的Western blot檢測(cè);左肺組織置于4%多聚甲醛溶液中，固定24 h后常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，切片采用HE染色。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PDCD4、α-SMA和COL-I在正常HFL-1細(xì)胞和TGF-β1處理的HFL-1細(xì)胞的表達(dá)情況

以正常HFL-1細(xì)胞為對(duì)照組，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，HFL-1+TGF-β1組的α-SMA和COL-I的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，PDCD4的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)圖1，提示 HFL-1細(xì)胞轉(zhuǎn)化為MB成功，肺纖維化細(xì)胞模型建立成功，PDCD4蛋白在MB中呈低表達(dá)。RT-qPCR結(jié)果顯示，對(duì)照組與HFL-1+TGF-β1組PDCD4 mRNA表達(dá)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，HFL-1+TGF-β1組α-SMA和COL-I的mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比明顯上調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 1.The protein expression of PDCD4, α-SMA and COL-I in HFL-1 group and HFL-1+TGF-β1 group. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs HFL-1 group.

2 pEZ-M03-PDCD4轉(zhuǎn)染肌成纖維細(xì)胞后其PDCD4蛋白的表達(dá)情況

將肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)48 h后分別提取空白對(duì)照組、pEZ-M03-PDCD4組和pEZ-M03組總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組及pEZ-M03組比較， pEZ-M03-PDCD4組PDCD4的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)；pEZ-M03組和空白對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，說(shuō)明pEZ-M03-PDCD4已成功轉(zhuǎn)染HFL1 細(xì)胞并過(guò)表達(dá)PDCD4蛋白,見(jiàn)圖3。

Figure 2.The mRNA expression of PDCD4, α-SMA and COL-I in HFL-1 group and HFL-1+TGF-β1 group. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs HFL-1 group.

Figure 3.The protein expression of PDCD4 in the MB transfec-ted with pEZ-M03-PDCD4. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs blank control group and pEZ-M03 group.

3 PDCD4過(guò)表達(dá)對(duì)肌成纖維細(xì)胞活力的影響

轉(zhuǎn)染pEZ-M03-PDCD4后，分別檢測(cè)空白對(duì)照組、pEZ-M03-PDCD4組和pEZ-M03組24、48和72 h時(shí)點(diǎn)的A值，繪制細(xì)胞活力曲線，發(fā)現(xiàn)pEZ-M03-PDCD4組的細(xì)胞活力較pEZ-M03組及空白對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，pEZ-M03組及空白對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，表明PDCD4 可顯著抑制肌成纖維細(xì)胞的活力，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The viability of the MB transfected with pEZ-M03-PDCD4 detected by CCK-8 assay. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs blank control group and pEZ-M03 group.

4 PDCD4過(guò)表達(dá)對(duì)PI3K/AKT通路及細(xì)胞周期蛋白c-Myc和cyclin D1表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組和pEZ-M03組相比，pEZ-M03-PDCD4組細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白c-Myc和cyclin D1的蛋白表達(dá)都顯著減少(P<0.05), PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白p-AKT的蛋白水平顯著減少(P<0.05)，LY294002組的p-AKT蛋白水平也顯著降低(P<0.05)，pEZ-M03組與空白對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見(jiàn)圖5。

5 PDCD4過(guò)表達(dá)對(duì)上清液中羥脯氨酸含量的影響

與HFL-1組相比，空白對(duì)照組、pEZ-M03組和pEZ-M03-PDCD4組培養(yǎng)上清液中的羥脯氨酸含量均顯著增加(P<0.01);與空白對(duì)照組和pEZ-M03組相比，pEZ-M03-PDCD4組培養(yǎng)上清液中的羥脯氨酸含量顯著減少(P<0.05),見(jiàn)圖6。

6 小鼠肺組織病理觀察及PDCD4蛋白在模型組和對(duì)照組的表達(dá)情況

光鏡觀察可見(jiàn)，對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常，模型組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見(jiàn)大量肺泡消失及纖維組織增生，見(jiàn)圖7A。與對(duì)照組比較，模型組PDCD4的蛋白表達(dá)減少(P<0.01)，見(jiàn)圖7B。

討 論

PDCD4是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的與凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)的抑癌基因[17],在人類組織中，例如肝、肺、腦、皮膚、胰腺及卵巢等組織都有表達(dá)。但近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)PDCD4在肝纖維化和心肌纖維化的肌成纖維細(xì)胞中呈低表達(dá)[5-6]。然而，PDCD4是否參了肺纖維化的發(fā)生發(fā)展目前尚不清楚。故本實(shí)驗(yàn)首先以TGF-β1 誘導(dǎo)建立肺纖維化細(xì)胞模型[17]，誘導(dǎo)后的模型即使在沒(méi)有TGF-β1的情況下也很穩(wěn)定[18]。以HFL-1細(xì)胞為對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)PDCD4在TGF-β1處理的HFL-1細(xì)胞中其蛋白水平顯著下調(diào)，但其mRNA水平無(wú)明顯變化，此現(xiàn)象可能是MB中PDCD4蛋白翻譯水平較低或(和)PDCD4蛋白降解增多引起的。

Figure 5.The protein levels of c-Myc, cyclin D1, AKT and p-AKT in the MB cells transfected with pEZ-M03-PDCD4. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs blank control group and pEZ-M03 group.

Figure 6.The effects of PDCD4 over-expression on the hydroxyproline content in the MB of each group. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs HFL-1 group; #P<0.05 vs blank control group.

PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，其在維持細(xì)胞正常生理功能如生長(zhǎng)、代謝和分化中起著非常關(guān)鍵的作用[19]。PI3K/AKT通路被證實(shí)存在于人體的許多生理功能中，大量證據(jù)說(shuō)明抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，而且這一通路與纖維化疾病有緊密的關(guān)系。但是，在體外實(shí)驗(yàn)綜上所述，過(guò)表達(dá)MB內(nèi)抑癌基因PDCD4，通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路及細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和c-Myc抑制細(xì)胞活力，減少膠原蛋白的分泌。這對(duì)于應(yīng)用PDCD4靶向分子治療肺纖維化疾病提供了理論依據(jù)。

Figure 7.HE staining of mouse lung tissue sections (A;×200) and the protein expression of PDCD4 in the lung tissues of model group and control group (B). Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs control group.