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        基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建SETD2基因敲除鼻咽癌細胞株并分析其增殖特性*

        2018-12-27 07:14:46王思思廖曉敏邵鐘銘袁建玲封慕茵哈艷平李汝佳申志華
        中國病理生理雜志 2018年12期
        關(guān)鍵詞:細胞株細胞系細胞周期

        王思思, 廖曉敏▲, 邵鐘銘, 袁建玲, 封慕茵, 哈艷平, 李汝佳, 申志華, 揭 偉△

        (廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1病理學(xué)系, 2病理生理教研室, 廣東 湛江 524023)

        基于非基因組DNA突變的表觀遺傳學(xué)調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)中的重要機制之一,通過甲基化、乙?;?、磷酸化、泛素化和其它多種修飾方式調(diào)節(jié)基因的表達[1-2]。人類SETD2基因位于第3號染色體短臂的2區(qū)1帶(3p21.31), 長度大約為192 kb, 包括23個外顯子和22個內(nèi)含子。SETD2蛋白是組蛋白H3第36號位賴氨酸三甲基化(H3K36me3)轉(zhuǎn)移酶[3]。H3K36me3 作為基因活化標(biāo)志,參與基因轉(zhuǎn)錄起始的抑制、生物的生長發(fā)育、轉(zhuǎn)錄因子p53的激活及DNA的修復(fù)等眾多生物學(xué)過程。近年發(fā)現(xiàn)SETD2基因在多種人類腫瘤中存在突變,其表達普遍呈下降趨勢,具有抑癌基因作用,可能是腫瘤治療的潛在靶點[4-6],但SETD2基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的確切機制尚不清楚。

        鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我國華南地區(qū)的多發(fā)性惡性腫瘤,具有顯著的流行病學(xué)特征。NPC的發(fā)生、發(fā)展是多因素綜合作用的結(jié)果,與遺傳易感性、EB病毒感染及環(huán)境因素等緊密相關(guān)。我們課題組前期就NPC的發(fā)病機制進行了系列研究,發(fā)現(xiàn)了一些與NPC臨床侵襲、進展密切相關(guān)的基因表達或信號異常,為進一步闡明NPC的發(fā)病學(xué)提供了新的線索[7-12]。迄今,與NPC高度相關(guān)且具有臨床轉(zhuǎn)化意義的分子治療靶點的涉疑基因仍少見。SETD2與NPC的報道極少[13], SETD2異常在NPC中的發(fā)生和發(fā)展中是否發(fā)揮作用尚不清楚。

        基因組編輯是指對目標(biāo)基因進行定向操作,實現(xiàn)對特定DNA片段的敲除或加入等。以ZFN (zinc-finger nucleases)和TALEN (transcription activator-like effector nucleases)為代表的序列特異性核酸酶技術(shù)能夠高效率地進行定點基因組編輯, 在基礎(chǔ)研究、基因治療和遺傳改良等方面展示出了巨大的潛力。近來開發(fā)并不斷完善的成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR相關(guān)蛋白9(CRISPR-associated protein 9, Cas9)技術(shù)是繼ZFN和TALEN之后出現(xiàn)的第3代“基因組定點編輯技術(shù)”[14-15],具有高效、簡便的優(yōu)點,目前在基因組編輯中受到極大的重視。本研究擬應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù),對高表達SETD2的NPC細胞進行基因組編輯獲得SETD2基因敲除的穩(wěn)定細胞株,初步分析SETD2在NPC增殖中的作用,為后續(xù)深入研究NPC中SETD2的生物學(xué)功能及分子機制提供參考資料。

        材 料 和 方 法

        1 細胞系

        永生化鼻咽黏膜上皮細胞系NP-69、高分化鼻咽癌細胞系CNE1、低分化鼻咽癌細胞系CNE2Z及未分化鼻咽癌細胞系C666-1均為我室保存。

        2 主要試劑及儀器

        基于pCRISPR-CG01質(zhì)粒(元件序列:U6-sgRNA-CMV-T7-Cas9-Sv40-mCherry-IRES-Neo)構(gòu)建的含針對人SETD2基因的CRISPR/Cas9質(zhì)粒及相應(yīng)小向?qū)NA(small guide RNA,sgRNA)均委托GeneCopoeia旗下廣州復(fù)能公司進行設(shè)計和制備。3條sgRNA靶向位點分別為5’-GATGGGGGATTTCTACGACC-3’、 5’-TCTAGTCGATTTTTGCCCAA-3’和5’-GGAGTCGAGTCTACCTGAAG-3’。pCRISPR-CG01質(zhì)粒物理圖譜參見GeneCopoeia相關(guān)網(wǎng)頁。DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(HyClone);NP-69上皮細胞專用培養(yǎng)液和Lipofectamine 3000(Invitrogen);蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、CCK-8試劑、NC膜和ECL發(fā)光液(碧云天);兔抗人SETD2 I抗(GeneTex);兔抗人增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、GAPDH和tubulin I抗(Cell Signaling Technology);兔抗人細胞周期素D1(cyclin D1)、cyclin B1、cyclin E1、cyclin A2、CDK2、CDK4、CDK6、p16、p21 I抗及HRP標(biāo)記的II抗(ProteinTech);TRIzol試劑(Ambion);RT-PCR試劑盒(TaKaRa);PCR引物(上海生工)。CO2培養(yǎng)箱(BNA-311型,Thermo);PCR儀(Eppendorf);轉(zhuǎn)膜儀及水平電泳系統(tǒng)(BioRad);FACS Canto II型流式細胞儀(BD);酶標(biāo)儀(BioTek);凝膠成像系統(tǒng)(上海天能)。

        3 方法

        3.1細胞培養(yǎng) 參考既往方法進行細胞培養(yǎng)[8-11]。簡言之,NP-69細胞用含5% 胎牛血清的上皮細胞專用培養(yǎng)液重懸,接種于6 cm培養(yǎng)皿,置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng),每3 d換液一次;CNE1、CNE2Z及C666-1細胞均以含10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液重懸,接種于6 cm培養(yǎng)皿,置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng),每2天換液1次。取對數(shù)生長期細胞用于相關(guān)實驗。

        3.2CRISPR/Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及單克隆細胞株篩選和鑒定 CNE1細胞接種12孔板,將3種CRISPR/Cas9質(zhì)?;旌铣蒫ocktail,按Lipofectamine 3000說明書將3 μg混合質(zhì)粒轉(zhuǎn)至CNE1細胞。轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡下觀察紅色熒光的陽性情況并在孔板背面相應(yīng)位置做好標(biāo)記,將標(biāo)記處的細胞用0.25%胰酶消化并轉(zhuǎn)移至96孔板,調(diào)整濃度為每孔接種1個細胞,待生長出單克隆細胞后擴大培養(yǎng)并進行Western blot鑒定SETD2蛋白表達。

        3.3Western blot 各組細胞經(jīng)冷PBS洗滌,加入細胞裂解液提取總蛋白,應(yīng)用BCA法定量蛋白濃度。取30~50 μg蛋白進行SDS-PAGE,將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜。根據(jù)待檢測目的蛋白的分子量大小,將NC膜剪成一定大小,各膜經(jīng)含5% BSA的TBST室溫?fù)u床上封閉1 h,TBST洗滌3次后與相應(yīng)I抗4 ℃孵育過夜,各抗體稀釋比例如下: SETD2, 1∶500; PCNA, 1∶500; cyclin D1, 1∶500; cyclin B1, 1∶500; cyclin A2, 1∶500; cyclin E1, 1∶500; CDK2, 1∶500; CDK4, 1∶500; CDK6, 1∶500; p16, 1∶500; p21, 1∶500; Tubulin, 1∶3 000; GAPDH, 1∶500。TBST洗滌3遍,每遍15 min,各膜再與HRP-標(biāo)記IgG室溫下結(jié)合1 h,洗滌后經(jīng)ECL發(fā)光液顯影,凝膠成像分析系統(tǒng)掃描條帶,ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。實驗重復(fù)3次。

        3.4RT-PCR TRIzol提取細胞總RNA,紫外分光光度計測定A260/280以判斷RNA濃度及純度,取500 ng 總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。經(jīng)PCR在線引物設(shè)計平臺(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計跨外顯子引物。SETD2(NM_014159.6)上游引物序列為5’-CCTCTTCTGCCTATGAGCGG-3’, 下游引物序列為5’-ATGTGGCACCACTGGTACTG-3’,PCR產(chǎn)物434 bp; 內(nèi)參照GAPDH(NM_002046.6)上游引物序列為5’-CCGCATCTTCTTTTGCGTCG-3’, 下游引物序列為5’-TGGAATTTGCCATGGGTGGA-3’,PCR產(chǎn)物217 bp。20 μL PCR體系含PCR 2×buffer 10 μL(含Taq酶及dNTPs)、cDNA 4 μL、引物1.6 μL (含上、下游)和ddH2O 4.4 μL。 PCR循環(huán)參數(shù): 94 ℃預(yù)變性2 min; 94 ℃ 40 s, 60 ℃ 40 s, 72 ℃ 60 s,共35個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)拍照,ImageJ軟件分析條帶灰度值。實驗重復(fù)3次。

        3.5CCK-8檢測細胞活力 細胞按每孔2×103個接種于96孔板,過夜孵育貼壁。按貼壁后培養(yǎng)時間0 h、24 h、48 h及72 h每孔加入10 μL CCK-8試劑,37 ℃繼續(xù)孵育3 h,酶標(biāo)儀上讀取450 nm的吸光度,每組5個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。

        3.6平板集落形成實驗 細胞按每皿200個接種于3 cm培養(yǎng)皿,每2 d換液一次,連續(xù)培養(yǎng)14 d。取出培養(yǎng)皿,PBS洗滌1次,4%中性甲醛固定細胞30 min,PBS洗滌2次,0.1%結(jié)晶紫染色15 min,PBS洗滌2次。統(tǒng)計≥50細胞的克隆數(shù)量并計算克隆形成率。每組3個復(fù)孔。

        3.7細胞周期分析 細胞接種于6孔板,48 h后收獲細胞,4%冷甲醛固定,PBS洗滌1次, 37 ℃、避光條件下細胞經(jīng)PI和RNasin處理15 min,采用BD FACS Canto II流式細胞儀分析細胞周期的分布,每組重復(fù)3孔。

        4 統(tǒng)計學(xué)處理

        使用GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 不同分化狀態(tài)NPC細胞系中SETD2的表達

        分別應(yīng)用半定量RT-PCR和Western blot檢測SETD2基因在不同分化狀態(tài)NPC細胞系中的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平,結(jié)果顯示,與永生化鼻咽黏膜上皮細胞系NP-69相比,高分化CNE1細胞、低分化CNE2Z細胞及未分化C666-1細胞中SETD2 mRNA及蛋白水平均呈逐漸下降趨勢(P<0.01),尤其是C666-1細胞中幾乎檢測不到SETD2 mRNA及蛋白,見圖1。

        Figure 1.Detection of SETD2 expression in nasopharyngeal carcinoma cells in various differentiation status by RT-PCR (A) and Wes-tern blot (B). Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NP-69 cells.

        2 基于CRISPR/Cas9技術(shù)成功敲除NPC細胞中的SETD2基因

        在明確了CNE1具有較高水平的SETD2表達后,我們采用CRISPR/Cas9方法對該細胞進行SETD2基因組編輯。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染,將含SETD2特異性sgRNA的質(zhì)粒導(dǎo)入細胞,在Cas9蛋白酶的作用下實現(xiàn)對靶DNA的切割。通過轉(zhuǎn)染后的細胞中mCherry發(fā)出的紅色熒光,初步篩選出轉(zhuǎn)染陽性的細胞。收集細胞,再通過有限稀釋法,將轉(zhuǎn)染陽性細胞接種至96孔板進行單克隆細胞篩選,最終挑選出15個單克隆細胞株,再經(jīng)過Western blot檢測,觀察到#2、#3、#4、#5、#9、#10、#11、#12、#13和#15等10個單克隆細胞株具有程度不等的SETD2蛋白水平下降,最終挑選#5和#9克隆作為SETD2基因敲除細胞,分別標(biāo)記為CNE1-SETD2-KO-#5和CNE1-SETD2-KO-#9,見圖2。以未進行編輯的細胞標(biāo)記為野生型即CNE1-WT。后續(xù)實驗即以這3個細胞株為實驗對象。

        Figure 2.Expression of SETD2 protein in the 15 monoclones of SETD2 knockout cell strains. Mean±SD. n=3.

        3 SETD2敲除促進了NPC細胞的活力

        CCK-8實驗結(jié)果提示,CNE1-SETD2-KO-#5和CNE1-SETD2-KO-#9細胞的活力均較同一時點的CNE1-WT細胞增加(P<0.05),見圖3A;Western blot結(jié)果證實,與CNE1-WT細胞相比,CNE1-SETD2-KO-#5和CNE1-SETD2-KO-#9細胞中PCNA蛋白表達顯著升高(P<0.01),見圖3B。平板集落形成實驗結(jié)果進一步證實,CNE1-SETD2-KO-#5和CNE1-SETD2-KO-#9細胞的集落形成效率均高于CNE1-WT細胞(P<0.01),見圖3C。

        Figure 3.SETD2 knockout promotes the proliferation of NPC cells. A: CCK-8 assay was used to examine the viability of CNE1 cells before and after SETD2 knockout; B: Western blot analysis of PCNA protein levels in CNE1 cells before and after SETD2 knockout; C: plate colony forming assay was used to detect the colony formation efficiency of CNE1 cells before and after SETD2 knockout. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 h; ##P<0.01 vs CNE1-WT.

        4 敲除SETD2后干擾了NPC細胞周期分布

        流式細胞術(shù)結(jié)果提示,與CNE1-WT細胞相比,CNE1-SETD2-KO-#5和CNE1-SETD2-KO-#9細胞G1期比例均下降(P<0.01),而S期和G2/M期比例也有一定水平的升高(P<0.05),見圖4。

        5 敲除SETD2后干擾了NPC細胞周期相關(guān)蛋白的表達

        Western blot檢測結(jié)果表明,SETD2基因敲除后CNE1-SETD2-KO-#5和CNE1-SETD2-KO-#9克隆中cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、CDK2和CDK4的表達增加,p21的表達減少(P<0.05), CDK6和p16表達改變不明顯,見圖5。

        討 論

        SETD2基因是編碼H3K36me3轉(zhuǎn)移酶的唯一基因,具有重要的生物學(xué)功能[3]。SETD2在DNA修復(fù),染色體分離和RNA剪接過程中發(fā)揮作用[16-18]。在多數(shù)人類腫瘤中均檢測到SETD2基因存在突變的情況[19]。迄今,SETD2基因表達異常在腎細胞癌[20- 21]、乳腺癌[22]、骨肉瘤[23]、胃癌[24]、淋巴瘤[25]、白血病[26]和肺癌[27]等均有報道。SETD2基因作為潛在抑癌基因,其低表達與腫瘤預(yù)后相關(guān),因而深入了解SETD2基因在人類腫瘤中的表達及失常機制對腫瘤的靶向治療具有重要的意義。

        Figure 4.Flow cytometry analysis of cell cycle distribution. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs CNE1-WT.

        Figure 5.The expression of cell cycle-related proteins. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs CNE1-WT.

        截止目前只有1篇有關(guān)SETD2與NPC的報道。研究表明,臨床轉(zhuǎn)移組NPC組織較未轉(zhuǎn)移組NPC組織中SETD2 mRNA水平下降[13],初步從流行病學(xué)角度提示了SETD2在NPC臨床進展中的作用,但缺乏具體分子機制的探索。為了解SETD2在NPC中的確切作用,我們首先對臨床NPC標(biāo)本中的SETD2蛋白進行了免疫組化的檢測,結(jié)果顯示相對于對照的鼻咽黏膜慢性炎癥組織,NPC腫瘤細胞中SETD2蛋白表達明顯下調(diào)(未發(fā)表資料),這一表達趨勢與前述多種人類腫瘤中SETD2蛋白表達下降的趨勢是一致的。隨后,以永生化鼻咽黏膜上皮細胞系NP-69為對照,對不同分化程度的NPC細胞系進了SETD2轉(zhuǎn)錄及翻譯產(chǎn)物的檢測,結(jié)果證實隨著分化程度的下降, SETD2的表達亦呈現(xiàn)下降趨勢,初步提示了SETD2與NPC腫瘤細胞惡性行為負(fù)相關(guān)。我們以SETD2表達水平最高的高分化NPC細胞系CNE1為對象,采用基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù),對CNE1細胞中SETD2基因進行敲除,最后從15個轉(zhuǎn)染了SETD2 特異sgRNA的單克隆細胞中成功篩選出2個SETD2敲除單克隆作為后續(xù)研究的對象。本研究采用GeneCopoeia新開發(fā)的pCRISPR-CG系列sgRNA表達載體不僅可表達sgRNA,還可同時表達Cas9核酸內(nèi)切酶,因此操作簡便。SETD2基因敲除NPC細胞株的成功構(gòu)建可為其生物學(xué)功能研究提供了基礎(chǔ)。

        對SETD2基因敲除前后的細胞進行增殖相關(guān)特性的分析表明,無論是檢測短期效應(yīng)的CCK-8實驗還是評估長期效應(yīng)的平板集落形成實驗,其結(jié)果均證實SETD2敲除后細胞活力得以增加,并在分子水平上也觀察到PCNA這一反映細胞增殖能力的蛋白表達水平也被上調(diào)。細胞周期分布上,SETD2基因敲除后顯著減少了G1期但增加S期及G2/M期分布。從分子水平上,觀察到SETD2基因敲除后顯著增加了cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、CDK2和CDK4的表達,明顯減低了p21的表達。細胞周期素、細胞周期素激酶及細胞周期素激酶抑制因子的協(xié)調(diào)表達是介導(dǎo)細胞周期進展的核心機制。已有報道,SETD2通過與p53作用進而影響多個下游基因如p21的表達[28],本項試驗再次證實了SETD2對p21的調(diào)節(jié)作用。然而,一項有關(guān)肌母細胞C2C12的研究中指出,SETDE2敲除后導(dǎo)致細胞增殖能力下降,表現(xiàn)為p21表達的上調(diào)及G1/S和G2/M周期轉(zhuǎn)換的障礙[29],這一結(jié)論與本研究恰好相反,提示了SEDT2對細胞周期的調(diào)節(jié)作用可能具有細胞類型的差異性。新近的一項研究也指出,SETD2基因是進化上保守的細胞周期調(diào)控基因,其突變可能是人類腫瘤發(fā)生的機制之一[30]。本研究首次證實,SETD2缺失可從多個細胞周期檢測點水平影響NPC細胞周期的進展。

        SETD2除了參與組蛋白修飾,還可修飾其他非組蛋白基因,如曹雪濤課題組新近發(fā)現(xiàn)SETD2可調(diào)節(jié)STAT1甲基化而參與IFNα依賴的抗病毒免疫[31]。由此可見,進一步闡明SETD2對基因表達調(diào)控的機制,發(fā)現(xiàn)有價值的下游靶基因,對疾病的防治具有重要的意義。

        總之,本研究結(jié)果提示NPC細胞系中SETD2表達呈普遍降低的趨勢,且SETD2基因缺失從多個分子水平上影響了細胞周期的分布,促進了細胞的增殖潛能?;贑RISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯對NPC中SETD2基因的定點編輯具有可行性,這為后續(xù)深入研究SETD2的功能提供了參考資料。

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