高楊，程毅，任明媛，岳育楊

黑色素瘤（黑素瘤）是一種好發(fā)于皮膚的高度惡性腫瘤，易轉(zhuǎn)移、死亡率高、預(yù)后差，缺乏有效的治療藥物［1-2］。近年來腫瘤的免疫治療研究進(jìn)展較快，美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）陸續(xù)批準(zhǔn)了抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）單克隆抗體ipilimumab、抗程序性死亡受體1蛋白（programmed cell death protein 1，PD-1）單克隆抗體nivolumab和pembrolizumab用于黑素瘤的治療［3］，但這些藥物可能導(dǎo)致自身免疫性疾病和胃腸毒性而使部分患者終止治療，因此繼續(xù)尋找有效的治療藥物仍是臨床急需解決的問題。斑蝥素是從斑蝥的干燥蟲體中提取的一種抗腫瘤活性成分，具有抗腫瘤、升白細(xì)胞、增強(qiáng)免疫、抗病毒、抑菌及抗氧化等作用［4］，去甲斑蝥素（noncantharidin，NCTD）是斑蝥素的衍生物，由人工合成，其毒副作用比斑蝥素低，具有獨(dú)特的升白細(xì)胞及較強(qiáng)的抗癌作用［5］。本研究通過NCTD作用于人黑色素瘤M14細(xì)胞，觀察NCTD對M14細(xì)胞增殖、凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的影響，并探討其可能的抗黑素瘤作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人M14黑素瘤細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；NCTD購于美國Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，CCK-8試劑購于日本同仁化學(xué)研究所，兔抗人β-actin一抗、兔抗人Bax一抗、兔抗人Bcl-2一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購于武漢ABclonal公司。倒置顯微鏡購于德國Leica公司，CO2培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司。

1.2 方法 M14細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)，待細(xì)胞融合達(dá)到90%以上時(shí)，按1∶2或1∶3的比例進(jìn)行傳代。

1.3 藥物處理 NCTD溶于DMSO中，配成100 g/L儲(chǔ)存液凍存于-20℃冰箱中備用，臨用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液配制成工作濃度。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活性 將對數(shù)生長期的M14細(xì)胞接種于96孔板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)平行孔，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組每孔加入100 μL的NCTD，濃度分別為50、100及500 μg/L，陰性對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，空白對照組只加培養(yǎng)基（無細(xì)胞）。分別作用24 h、48 h后，每孔加10 μL CCK-8試劑作用2 h，用酶標(biāo)儀測定每孔450 nm波長的吸光度（A）值并計(jì)算生長抑制率。生長抑制率=［（Ac-As）/（Ac-Ab）］×100%。（Ac：陰性對照孔；As：實(shí)驗(yàn)孔；Ab：空白對照孔）

1.5 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及DAPI核染色 將M14細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入以不同濃度的NCTD作用24 h后，4%多聚甲醛固定15 min，用PBS室溫清洗3遍，每次10 min，0.1%triton-X 100處理5 min，PBS室溫清洗3遍，每孔加入濃度為1 mg/L的DAPI染液，常溫避光孵育10 min，后用PBS清洗3遍后，于倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的變化。

1.6 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá) 藥物持續(xù)干預(yù)細(xì)胞24 h后，收集并裂解細(xì)胞，BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白量。樣本經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（100 V恒壓）分離，以凝膠面積0.65 mA/cm2恒流電轉(zhuǎn)移45 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入1∶1 000的兔抗人Bax一抗、兔抗人Bcl-2一抗，4℃孵育過夜，漂洗后加入1∶3 000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃避光孵育1 h，TBST洗滌，ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒曝光顯影。利用Image J圖像分析系統(tǒng)對條帶進(jìn)行分析和測量灰度值，以β-actin蛋白作為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多樣本比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NCTD抑制M14細(xì)胞增殖 CCK-8結(jié)果顯示，NCTD可抑制黑素瘤M14細(xì)胞的增殖，藥物作用24 h及48 h后各組的細(xì)胞生長抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為135.76、96.12，P＜0.05），經(jīng)兩兩比較，各時(shí)點(diǎn)時(shí)50 μg/L與陰性對照（0 μg/L）組的抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Effects of different concentrations of norcantharidin on the proliferation of melanoma M14 cells圖1 不同濃度NCTD對黑素瘤M14細(xì)胞增殖的影響

2.2 NCTD誘導(dǎo)M14細(xì)胞凋亡情況 經(jīng)NCTD處理過的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，輪廓不規(guī)整，胞核皺縮，體積變小，細(xì)胞黏附性差，漂浮細(xì)胞增多，見圖2。DAPI染核后通過熒光顯微鏡觀察，未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞核形態(tài)正常，經(jīng)藥物處理過的細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核邊集及凋亡小體，見圖3。

Fig.2 The effect of different concentrations of norcantharidin on the morphology of melanoma M14 cells（×200）圖2 倒置顯微鏡下觀察不同濃度NCTD對黑素瘤M14細(xì)胞形態(tài)的影響（×200）

2.3 NCTD影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 0、50、100及500 μg/L組凋亡抑制蛋白Bcl-2相對表達(dá)量依次為0.84±0.09、0.81±0.07、0.61±0.11、0.44±0.07，呈逐漸降低趨勢（F=16.059，P＜0.05）。凋亡相關(guān)蛋白Bax相對表達(dá)量依次為0.04±0.01、0.52±0.05、0.71±0.06、0.82±0.09，呈逐漸升高趨勢（F=139.822，P＜0.05），見圖4。

Fig.3 Effect of different concentrations of norcantharidin on melanoma M14 cell nuclei under fluorescence microscope（DAPI，×AP0）圖3 熒光顯微鏡下觀察不同濃度NCTD對黑素瘤M14細(xì)胞核的影響（DAPI，×AP0）

3 討論

惡性黑素瘤起源于神經(jīng)外胚葉，近年來其發(fā)病率呈大幅度持續(xù)上升趨勢，在女性中的增長速度僅次于肺癌，在男性則是腫瘤中增長速度最快的一型［6］。惡性黑素瘤大多數(shù)由黑痣惡變而來，原發(fā)病變90%在皮膚，多發(fā)生于頭皮、頸部、手掌、小腿、足底、指（趾）等，也可發(fā)生在軀干皮膚，少數(shù)發(fā)生于皮膚以外的部位，如眼內(nèi)、食管、直腸和肛門、陰道等。晚期黑素瘤對放療和化療不敏感，預(yù)后差，因此尋找治療黑素瘤的有效藥物是臨床上亟待解決的問題，近年來美國FDA已陸續(xù)批準(zhǔn)了干擾素［7］和免疫檢查點(diǎn)抑制劑［3］等藥物用于晚期黑素瘤的治療，但遠(yuǎn)期療效還有待于進(jìn)一步觀察。

斑蝥是我國的傳統(tǒng)中藥，斑蝥素是一種倍半萜類衍生物，是斑蝥抗癌的有效成分，然而斑蝥素可引起強(qiáng)烈的消化道反應(yīng)，損傷腎功能。NCTD為斑蝥素的衍生物，是人工合成的一種新型抗癌藥物，化學(xué)結(jié)構(gòu)與斑蝥素相似［5］，目前已有研究表明，NCTD能顯著抑制人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的增殖、侵襲、黏附、遷移能力，其機(jī)制可能與下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）、MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)［8］；NCTD還能夠抑制骨髓瘤U266細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，認(rèn)為可能與調(diào)控Notch信號(hào)通路有關(guān)［9］；此外，NCTD可通過阻滯細(xì)胞周期誘導(dǎo)肺腺癌A549［10］和胃癌SGC-7901細(xì)胞［11］凋亡；并通過抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞［12］血管生成能力而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而其在黑素瘤中的作用尚鮮見報(bào)道。

Fig.4 The protein expressions of Bax and Bcl-2 in different groups of melanoma M14 cells圖4 不同濃度NCTD對黑素瘤M14細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)通過NCTD體外作用于人黑色素瘤M14細(xì)胞，應(yīng)用CCK-8法證實(shí)了NCTD對黑素瘤細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用，并呈劑量依賴性。熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核固縮、核邊集及凋亡小體等細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，證實(shí)NCTD對人黑色素瘤M14細(xì)胞有抑制增殖作用，這與已發(fā)現(xiàn)的NCTD對骨髓瘤U266細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞等的作用相同，說明NCTD確有抑制細(xì)胞增殖功能，但處理24、48 h時(shí)50 μg/L組與陰性對照組的抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示藥物需達(dá)到較高濃度才能起效，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。Bcl-2和Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要分子［13］。因此，結(jié)合上述研究，筆者認(rèn)為NCTD可促進(jìn)黑素瘤M14細(xì)胞中促凋亡分子Bax的表達(dá)，抑制抗凋亡分子Bcl-2的表達(dá)，由此可進(jìn)一步誘導(dǎo)黑素瘤M14細(xì)胞的凋亡，推測NCTD誘導(dǎo)黑素瘤M14細(xì)胞凋亡的機(jī)制與促進(jìn)Bax和抑制Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，NCTD可有效抑制黑素瘤M14細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)，NCTD有望成為輔助治療惡性黑素瘤的藥物之一。