黃飛飛 毛應(yīng)德龍

作者單位：浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科（黃飛飛）、骨科（毛應(yīng)德龍）（杭州310005）

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種常見的遲發(fā)性退行性關(guān)節(jié)病，目前關(guān)于OA 的病因?qū)W或骨重建與軟骨退化的相對重要性知之甚少。近年研究顯示，除年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、種族和創(chuàng)傷等因素外外，還有許多遺傳因素被確定與OA 的發(fā)病有關(guān)[1-2]。Toll 樣受體（TLRs）是一類模式識別分子，在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮獨特的功能[3]。TLR-9 位于染色體3p21.2 上，通過其配體刺激TLR-9 觸發(fā)所有TLR 共有的信號傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致核因子-κB（NF-κB）轉(zhuǎn)錄因子的激活和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[4]。本研究通過檢測TLR9 基因rs187084 和rs5743836 位點單核苷酸多態(tài)性，探討其基因多態(tài)性與膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）易感性的關(guān)系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2013 年4 月—2017 年5 月期間浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的145 例KOA 患者作為研究組，同時期招募145 名健康受試者作為對照組，膝骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度采用Kellgren-Lawrence 分級[5]評價，研究組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）其它類型的關(guān)節(jié)炎；（2）既往有膝關(guān)節(jié)外傷手術(shù)史；（3）患有代謝性骨?。唬?）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者；（5）患有糖尿病、高血壓的患者。對照組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往有膝關(guān)節(jié)外傷手術(shù)史；（2）患有免疫系統(tǒng)疾病的患者；（3）患有代謝性骨病的患者。本研究獲得我醫(yī)院學(xué)倫理委員會審核通過，所有受試者均簽署知情同意書。

表1 研究組和對照組一般資料比較

圖1 TLR9 基因rs187084 位點和rs5743836 位點測序結(jié)果。A-C 分別為rs187084 位點TT、TC、CC 基因型測序結(jié)果。D-F 分別為rs5743836 位點CC、CT、TT 基因型測序結(jié)果

1.2 方 法 取所有受試者靜脈血2mL，采用EDTA-K2 抗凝后采用硅膠模技術(shù)純化受試者基因組DNA，試劑盒為QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit（品牌：Qiagen，型號61104），保存于-20℃冰箱。根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中TLR9 基因rs187084 和rs5743836 位點序列信息設(shè)計PCR 擴增引物，rs187084 位點引物序 列 為 上 游：5’-ACTGGATCCTGGGGATGCAGA-3’，下游：5’-AGCTGACATTCCAGCAGGGGA-3’。rs5743836 位點引物序列為上游：5’-CGGAAGATG TTGCAAGGCTGT-3’，下游：5’-GGGCCAGGGTGTA GCTTGAG-3’。引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。

1.3 基因分型 根據(jù)設(shè)計的引物，以提取的基因組DNA 作為模板進(jìn)行PCR 擴增，反應(yīng)體系為20μL，其中基因組DNA 50ng，10×PCR 緩沖液2μL，1.5μL 25mmol/L 的Mg2+，1μL 10μmol/L dNTP，10pmol/L 的上下游引物各1μL，DNA 聚合酶1U，無菌水補足至20μL。PCR 翻譯條件為：95℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30 個循環(huán)后72℃延伸5min。PCR 完成后將PCR 擴增產(chǎn)物送上海生工生工生物工程技術(shù)公司進(jìn)行測序，分析受試者TLR9 基因rs187084 和rs5743836 位點基因型，結(jié)果見圖1。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0 軟件，計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗。計數(shù)資料以[例（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗。用χ2檢驗分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡。使用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗分析等位基因和基因型頻率的差異，估計比值比（OR）和95%置信區(qū)間（CI）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究組與對照組基線資料比較 兩組受試者的年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、性別、Kellgren-Lawrence 分級等一般資料見表1，研究組患者年齡、BMI 均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 TLR9 基因SNP 與膝骨關(guān)節(jié)炎風(fēng)險的相關(guān)性TLR9 基因rs187084 位點和rs5743836 位點基因型頻率符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。rs187084位點基因型頻率在研究組和對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.42，P=0.01），CC 基因型是膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）的保護(hù)因素（OR=0.321，95%CI=0.147-0.690，P=0.001），C 等位基因是膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）發(fā)生的保護(hù)因素（OR=0.599，95%CI=0.424-0.847，P=0.002）。rs5743836 位點基因型頻率在研究組和對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.14，P=0.08），T 等位基因不是膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）發(fā)生的危險因素（OR=0.680，95%CI=0.417-1.108，P=0.102），見表2。

2.3 TLR9 基因SNP 與性別之間的相關(guān)性 比較不同性別之間TLR9 基因rs187084 位點和rs5743836位點基因型頻率之間的差異結(jié)果顯示，TLR9 基因rs187084 位點和rs5743836 位點基因型頻率在男性和女性之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表2 研究組和對照組TLR9 基因SNP 與KOA 風(fēng)險的相關(guān)性位點基因型和等位基因頻率[例（%）]

表3 TLR9 基因SNP 與性別之間的相關(guān)性[例（%）]

2.4 TLR9 基因SNP 與年齡之間的相關(guān)性 以55歲為界限，比較不同年齡下TLR9 基因rs187084 位點和rs5743836 位點基因型頻率之間的差異，結(jié)果顯示，不同年齡受試者的TLR9 基因rs187084 位點基因型頻率之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），TT 基因型頻率在55 歲以上年齡段受試者中較高，而CC 基因型頻率在55 歲以下受試者中較高。rs5743836 位點基因型頻率在不同年齡受試者之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

2.5 TLR9 基因SNP 與KOA 嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析TLR9 基因rs187084 位點和rs5743836 位點基因型頻率與Kellgren-Lawrence 分級之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，TLR9 基因rs187084 位點基因型頻率與Kellgren-Lawrence 分級相關(guān)，CC 基因型頻率在3 級和4 級KOA 患者中較低（OR=0.14，95%CI=0.040-0.473，P＜0.001），TC 基因型與Kellgren-Lawrence 分級無相關(guān)性（P＞0.05）。rs5743836 位點各基因型頻率與Kellgren-Lawrence 分級無相關(guān)性（P＞0.05），見表5。

表4 TLR9 基因SNP 與年齡之間的相關(guān)性[例（%）]

表5 TLR9 基因SNP 與Kellgren-Lawrence 分級相關(guān)性[例（%）]

3 討 論

TLR 有兩個非常重要的功能，首先，TLRs 通過識別微探針相關(guān)的分子模式與先天性和適應(yīng)性抗感染宿主防御的激活有關(guān)；其次，TLR 在自身炎癥和炎性因子產(chǎn)生中起重要作用[6]。TLR9 可以識別非甲基化的富含CpG 和病原體來源的DNA 序列[7]，并通過刺激B 細(xì)胞增加自身免疫性疾病的風(fēng)險[8]。

TLR9 基因的rs187084 多態(tài)性位于啟動子區(qū)域，Haploview 篩選發(fā)現(xiàn)它是一個標(biāo)記SNP。因此，TLR9基因rs187084 多態(tài)性與相關(guān)疾病之間的關(guān)聯(lián)已被廣泛研究，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）[9]、骨關(guān)節(jié)炎[10]、瘧疾[11]和膿毒癥[12]。研究表明，在SLE 患者中發(fā)現(xiàn)TLR9過表達(dá)[13]，這可能刺激B 細(xì)胞并誘導(dǎo)SLE 發(fā)病。近年研究顯示，TLR9 可能在OA 的病因?qū)W中發(fā)揮著重要的功能，TLR9 通過夠激活NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子來影響促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而促進(jìn)OA 的發(fā)展[14]。另外，有研究證實，TLR9 基因SNP 影響基因表達(dá)和功能[15]。

TLRs 是與先天和獲得性免疫反應(yīng)有關(guān)的基本分子[16]。許多研究關(guān)注TLR9 啟動子多態(tài)性（rs187084）與自身免疫性疾?。ㄈ鏢LE）之間的關(guān)聯(lián)[9]，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[17]和OA[18]。此外，有研究顯示，TLR9 基因rs5743836 位點單核苷酸多態(tài)性與非霍奇金淋巴瘤（NHL）發(fā)生相關(guān)，rs5743836 位點突變的患者的單核細(xì)胞中TLR9 的轉(zhuǎn)錄活性增加[19]。本研究的目的是分析TLR9 基因的rs187084 位點和rs5743836 位點單核苷酸多態(tài)性與KOA 易感性的關(guān)系，結(jié)果顯示，研究組患者中攜帶rs187084 位點突變型等位基因C的頻率顯著低于對照組，說明rs187084 位點C 等位基因是KOA 的保護(hù)因素，與Balbaloglu 等[18]研究結(jié)果一致。另外，Suet 等[20]研究了中國臺灣人群TLR9基因rs187084 位點多態(tài)性與膝骨關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，rs187084 多態(tài)性的T 等位基因與OA 的風(fēng)險增加有關(guān)，同樣與本研究結(jié)果一致。本研究并未發(fā)現(xiàn)rs5743836 位點多態(tài)性與KOA 易感性之間的相關(guān)性，而在Carvalho 等[21]研究中發(fā)現(xiàn)TLR9基因rs5743836 多態(tài)性與TLR9 介導(dǎo)的疾病發(fā)生相關(guān)，攜帶TC 基因型rs5743836 的單核細(xì)胞中，IL-6上調(diào)TLR9 表達(dá)，導(dǎo)致對CpG 的細(xì)胞響應(yīng)加劇，包括IL-6 產(chǎn)生和B 細(xì)胞增殖。本研究并未觀察到這種相關(guān)性，筆者分析認(rèn)為可能與樣本量過小有關(guān)。

年齡和性別等因素也與KOA 的發(fā)生相關(guān)[22]，本研究同時還分析了TLR-9 基因的rs187084 位點和rs5743836 位點單核苷酸多態(tài)性與年齡、性別相關(guān)性，結(jié)果顯示，TLR9 基因rs187084 位點和rs5743836位點基因型頻率在男性和女性之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），說明這兩個位點與性別無相關(guān)性，而在不同年齡受試者中rs187084 位點基因型頻率有顯著差異，具體表現(xiàn)為在高年齡受試者中TT 基因型頻率較高，結(jié)合老年患者KOA 風(fēng)險高我們可以發(fā)現(xiàn)，TT基因型受試者是KOA 危險因素。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，TLR9 基因rs187084 位點基因型頻率與Kellgren-Lawrence 分級相關(guān)，CC 基因型頻率在Kellgren-Lawrence 分級3 級和4 級中較低，說明KOA 越嚴(yán)重，CC 基因型頻率越低，由此可見C 等位基因是KOA 的保護(hù)因素。

本研究有以下不足之處。首先，吸煙、飲酒等生活習(xí)慣因素可能會對結(jié)果產(chǎn)生影響。其次，樣本量相對較小，統(tǒng)計分析的功效較差。第三，在這項基于醫(yī)院的病例對照研究中，選擇偏倚是不可避免的。最后，由于有限的臨床信息，未進(jìn)一步的亞組分析。

綜上所述，TLR9 基因rs187084 1486 T>C 位點單核苷酸多態(tài)性與KOA 易感性相關(guān)，rs5743836 1237 C>T 位點單核苷酸多態(tài)性與KOA 易感性不相關(guān)。還需要進(jìn)一步擴大樣本量進(jìn)行驗證。