董穎 張雄 龔燕玲 古茂群 曾權(quán)祥

[摘要]目的 檢測急性髓系白血病（AML）患者Fms樣酪氨酸激酶3（FLT3）、核磷蛋白1（NPM1）、Ⅲ型酪氨酸激酶（C-KIT）及髓系轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白-a（CEBPA）基因表達情況，探討基因突變者臨床特征。方法 選取2015年4月～2017年4月我院的80例AML患者，檢測骨髓染色體核型及基因突變情況，比較各基因突變患者的臨床特征及預(yù)后相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果 80例AML患者中，染色體核型正常占比43.75%，異常占比56.25%；FLT3-ITD、NPM1、C-KIT-D861V、CEBPA基因突變陽性檢出率分別為15.00%、17.50%、7.50%、8.75%，對應(yīng)正常核型中檢出率分別為25.71%、28.57%、0.00%、20.00%；FLT3-ITD基因突變陽性組骨髓原始細胞比例顯著高于FLT3-ITD基因突變陰性組（P<0.05），而血紅蛋白（Hb）濃度、免疫表型CD117及人類白細胞抗原DR（HLA-DR）表達陽性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；NPM1基因突變、C-KIT-D861V基因突變陽性組與陰性組的骨髓原始細胞比例、Hb濃度、免疫表型CD117及HLA-DR表達陽性率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；CEBPA基因雙突變的Hb濃度顯著高于陰性組（P<0.05），而骨髓原始細胞比例、免疫表型CD117及HLA-DR表達陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；FLT3-ITD突變陽性組的完全緩解（CR）率、1年無病生存（DFS）率及1年內(nèi)總生存（OS）率均顯著低于陰性組（P<0.05），NPM1突變、C-KIT-D861V突變、CEBPA雙突變陽性組與陰性組在CR率、DFS率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但NPM1突變、CEBPA雙突變陽性組的OS率顯著高于陰性組（P<0.05），C-KIT-D861V突變陽性組的OS率顯著低于陰性組（P<0.05）。結(jié)論 AML患者FLT3、NPM1、C-KIT、CEBPA不同基因突變者顯示出一定程度不同臨床特征，F(xiàn)LT3、C-KIT基因突變者預(yù)后不良，NPM1、CEBPA基因突變者預(yù)后良好。

[關(guān)鍵詞]急性髓系白血??；Fms樣酪氨酸激酶3基因；核磷蛋白1基因；Ⅲ型酪氨酸激酶基因；髓系轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白-a基因；基因突變

[中圖分類號] R551.3 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）11（a）-0007-04

Clinical study of gene risk stratification in acute myeloid leukemia

DONG Ying ZHANG Xiong GONG Yan-ling GU Mao-qun ZENG Quan-xiang

Department of Hematology， Maoming People′s Hospital， Guangdong Province， Maoming 525000， China

[Abstract] Objective To detect the expression of Fms-like tyrosine 3 （FLT3）， nucleophosmin 1 （NPM1）， type Ⅲ tyrosine kinase （C-KIT） and myeloid transcription factor CCAAT enhancer binding protein-a （CEBPA） genes in patients with acute myeloid leukemia （AML） and to explore the clinical features of gene mutations. Methods A total of 80 cases of AML patients in our hospital from April 2015 to April 2017 were selected， and the bone marrow karyotype and gene mutations were detected， and the clinical features and prognosis-related indexes of each gene mutation were compared. Results Among 80 AML patients， the proportion of normal karyotype was 43.75%， and the proportion of abnormal karyotype was 56.25%. The positive detection rates of FLT3-ITD， NPM1， C-KIT-D861V and CEBPA mutations were 15.00%， 17.50%， 7.50% and 8.75% respectively， and the detection rates of corresponding normal karyotype were 25.71%， 28.57%， 0.00% and 20.00% respectively. The proportion of bone marrow blasts in FLT3-ITD positive mutation group was significantly higher than that in FLT3-ITD negative mutation group （P<0.05）， but there was no statistically significant difference in hemoglobin （Hb） concentration， immunophenotype CD117 and human leukocyte antigen DR （HLA-DR） positive expression （P>0.05）. There was no significant difference in proportion of bone marrow blasts， Hb concentration， immunophenotype CD117 and HLA-DR positive expression rate between the positive group and the negative group of NPM1 mutation and C-KIT-D861V mutation （P>0.05）. The Hb concentration of double mutation of CEBPA gene of the positive group was significantly higher than that of the negative group （P<0.05）， and there was no significant difference in proportion of bone marrow blasts， immunophenotype CD117 and HLA-DR positive expression rate （P>0.05）. The complete remission （CR） rate， 1-year disease-free survival （DFS） rate and overall survival （OS） rate in the FLT3-ITD positive mutation group were significantly lower than those in the negative group （P<0.05）. The difference was not statistically significant in CR rate and DFS rate between the positive group and the negative group of NPM1 mutation， C-KIT-D861V mutation and CEBPA double mutation （P>0.05）， but the OS rate of the NPM1 mutation and CEBPA double mutation positive group was significantly higher than that of the negative group （P<0.05）， and the OS rate of the C-KIT-D861V positive mutation group was significantly lower than that of the negative group （P<0.05）. Conclusion Different mutations of FLT3， NPM1， C-KIT and CEBPA in AML patients show a certain degree of different clinical features. Patients with FLT3 and C-KIT mutations have poor prognosis， and patients with NPM1 and CEBPA mutations have good prognosis.

[Key words] Acute myeloid leukemia； Fms-like tyrosine 3； Nucleophosmin 1； Type Ⅲ tyrosine kinase； Myeloid transcription factor CCAAT enhancer binding protein-a； Gene mutations

急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）指來源于造血系統(tǒng)髓系原始細胞惡性增殖的急性白血病，與造血前體細胞基因突變關(guān)聯(lián)密切[1]。細胞遺傳學(xué)異常及基因突變在AML診斷、危險分層、預(yù)后評估中具有重要意義，臨床上，約55% AML患者可檢測出染色體異常，40%～50% AML患者染色體核型正常，可進行基因檢測進一步分層[2]。隨著學(xué)界對基因與疾病關(guān)系認識的深入、基因測序技術(shù)及比較基因組學(xué)等技術(shù)發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)，AML患者中可鑒別出多種異?；?，基因檢測對AML患者診斷、分型及治療均有重要指導(dǎo)意義[3]。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）指南中明確指出Fms樣酪氨酸激酶3（FLT3）、核磷蛋白1（NPM1）、Ⅲ型酪氨酸激酶（C-KIT）及髓系轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白-A（CEBPA）基因突變與AML危險度分層及預(yù)后的關(guān)系[4]。本研究通過對AML患者四項突變基因進行檢測，對患者預(yù)后進行分層，旨在為臨床個性化治療提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年4月～2017年4月我院血液內(nèi)科收治的80例AML患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合WHO（2016）造血和淋巴組織腫瘤分類[5]中AML診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡18～75歲，入院前未接受治療，對檢查、治療及研究均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并胃癌、結(jié)腸癌等其他惡性腫瘤，治療不配合或放棄治療者。80例AML患者中，男44例，女36例；年齡22～75歲，中位年齡52歲；根據(jù)英法美協(xié)作組（FAB）分型[6]，M1型8例，M2型26例，M3型19例，M4型8例，M5型16例，M6型3例。

1.2方法

采集患者骨髓標(biāo)本，通過骨髓涂片，檢測患者骨髓原始細胞比例；經(jīng)過抗凝、低滲處理、細胞接種、培養(yǎng)、固定、制片等程序，分析染色體核型；經(jīng)過抗凝、熒光標(biāo)記、避光孵育、離心、固定等程序，采用流式細胞儀及相關(guān)應(yīng)用軟件，分析髓系祖細胞抗原CD117及人類白細胞抗原DR（HLA-DR）表達情況；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)擴增FLT3、NPM1、C-KIT及CEBPA基因，檢測基因突變表達；采用毛細管電泳法，通過基因測序儀對突變基因產(chǎn)物進行序列分析，了解各突變基因在AML患者中占比情況。治療方法參考成人AML中國診療指南[7]，根據(jù)年齡、預(yù)后等級等給予相應(yīng)治療方案及監(jiān)測。

1.3觀察指標(biāo)

統(tǒng)計納入患者染色體核型及基因突變檢測結(jié)果，比較不同基因突變陽性組和陰性組骨髓原始細胞比例、血紅蛋白（Hb）水平、CD117級HLA-DR表達水平、染色體核型等臨床特征。觀察不同基因突變組一個標(biāo)準(zhǔn)劑量化療后的完全緩解（CR）率、1年無病生存（DFS）率及1年內(nèi)總生存（OS）率，其中所有癥狀、體征完全消失至少4周視為CR，CR到復(fù)發(fā)時間≥1年視為1年內(nèi)DFS，初診到死亡時間≥1年視為1年內(nèi)OS[8]。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗和方差分析，計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1染色體核型及基因突變檢測結(jié)果分析

80例AML患者中，染色體核型正常者35例（43.75%），染色體核型異常45例（56.25%）；FLT3-ITD基因突變陽性檢出共12例（15.00%），其中正常核型中檢出率為25.71%，顯著高于異常核型中的6.67%（P<0.05）；NPM1基因突變陽性者檢出14例（17.50%），其中正常核型中檢出率為28.57%，顯著高于異常核型中的8.89%（P<0.05）；C-KIT-D861V基因突變陽性檢出數(shù)6例（7.50%），其中正常核型中檢出率為0.00%，顯著低于異常核型中的7.50%（P<0.05）；CEBPA基因雙突變陽性檢出數(shù)7例（8.75%），其中正常核型中檢出率為20.00%，顯著高于異常核型中的0.00%（P<0.05）（表1）。

2.2 FLT3-ITD基因突變陽性組與陰性組臨床特征的比較

FLT3-ITD基因突變陽性組的骨髓原始細胞比例顯著高于FLT3-ITD基因突變陰性組（P<0.05），而Hb濃度、免疫表型CD117及HLA-DR表達陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

2.3 NPM1基因突變陽性組與陰性組臨床特征的比較

NPM1基因突變陽性組與陰性組的骨髓原始細胞比例、Hb濃度、免疫表型CD117及HLA-DR表達陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

2.4 C-KIT-D861V基因突變陽性組與陰性組臨床特征的比較

C-KIT-D861V基因突變陽性組與陰性組的骨髓原始細胞比例、Hb濃度、免疫表型CD117及HLA-DR表達陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表4）。

2.5 CEBPA基因雙突變陽性組與陰性組臨床特征的比較

CEBPA基因雙突變陽性組的Hb濃度顯著高于陰性組（P<0.05），而骨髓原始細胞比例、免疫表型CD117及HLA-DR表達陽性率的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表5）。

2.6不同基因突變組預(yù)后相關(guān)指標(biāo)的比較

FLT3-ITD突變陽性組的CR率、DFS率及OS率均顯著低于陰性組（P<0.05），NPM1突變陽性組與陰性組、C-KIT-D861V突變陽性組與陰性組、CEBPA雙突變陽性組與陰性組的CR率、DFS率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但NPM1突變陽性組的OS率顯著高于陰性組（P<0.05），C-KIT-D861V突變陽性組的OS率顯著低于陰性組（P<0.05），CEBPA雙突變陽性組的OS率顯著高于陰性組（P<0.05）（表6）。

3討論

FLT3基因位于13號染色體長臂，在定向造血干細胞表面優(yōu)先表達，與造血、免疫系統(tǒng)發(fā)育關(guān)聯(lián)緊密，與其配體（FL）結(jié)合產(chǎn)物可激活多種細胞信號通路，調(diào)控造血細胞增殖及分化。FLT3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)序列（FLT3-ITD）是常見突變類型，其表達產(chǎn)物可引起非依賴配體磷酸化，通過激活多種信號途徑，賦予細胞增殖或存活優(yōu)勢，可造成AML復(fù)發(fā)與難治[9-10]。NPM1主要定位于細胞核仁中，其表達蛋白參與中心體復(fù)制、DNA修復(fù)、胞核糖體合成及細胞凋亡等過程，在多種惡性腫瘤細胞中過表達。研究顯示，NPM1基因突變的AML患者對化療更敏感，預(yù)后較好[11-12]。C-KIT是Ⅲ型酪氨酸激酶家族成員之一，其基因定位于染色體4q12-13，配體為干細胞因子，可參與調(diào)控細胞增殖、分化及凋亡，C-KIT-D861V基因突變多發(fā)生于異常染色體核型中，可導(dǎo)致C-KIT受體持續(xù)激活，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，造成細胞惡性增殖，可增加AML患者復(fù)發(fā)風(fēng)險，是預(yù)后不良指標(biāo)之一[13-14]。CEBPA基因位于19號染色體長臂，在造血系統(tǒng)里僅于髓系細胞中表達，其編碼產(chǎn)物為一種維持造血系統(tǒng)粒系分化轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控細胞增殖與分化平衡，其基因突變有單突變及雙突變，單突變對預(yù)后影響存在爭議，而雙突變被劃分為預(yù)后良好指標(biāo)[15-16]。

染色體核型對AML患者有獨立預(yù)后價值[17]，本研究對80例AML患者基因檢測發(fā)現(xiàn)，80例AML患者中，染色體核型正常占比43.75%，染色體核型異常占比56.25%，與文獻報道的結(jié)果類似[18]。FLT3-ITD、NPM1、CEBPA基因突變多見于正常核型中，C-KIT基因突變主要發(fā)生于異常核型，本研究FLT3-ITD基因突變陽性檢出率15.00%，正常核型中檢出率25.71%，NPM1基因突變陽性者檢出率17.50%，正常核型中檢出率28.57%，C-KIT-D861V基因突變陽性檢出率7.50%，正常核型中檢出率0.00%，CEBPA基因雙突變陽性檢出率8.75%，正常核型中檢出率20.00%；與杜雅哲等[19-20]的報道類似。FLT3-ITD突變AML患者的骨髓原始細胞比例較高，CEBPA基因雙突變Hb水平較高[19]，與本研究結(jié)果顯示的FLT3-ITD基因突變陽性組骨髓原始細胞比例高于陰性組，CEBPA基因雙突變陽性組Hb濃度顯著高于陰性組研究結(jié)果一致；NPM1基因突變、C-KIT-D861V基因突變陽性組與陰性組在骨髓原始細胞比例、Hb濃度、免疫表型CD117及HLA-DR表達陽性率均未見明顯差異，與報道[20]中NPM1突變者CD117低表達等結(jié)果有一定出入，可能與研究樣本有關(guān)。另外，本研究顯示FLT3-ITD突變陽性組CR率、DFS率及OS率均低于陰性組，C-KIT-D861V突變陽性組OS率顯著低于陰性組，NPM1突變、CEBPA雙突變陽性組OS率顯著高于陰性組，與報道[3，10]中的FLT3-ITD突變、C-KIT-D861V突變預(yù)后不良，而NPM1突變、CEBPA雙突變預(yù)后良好等結(jié)果類似。

綜上所述，AML患者存在基因突變情況，不同基因突變患者在臨床特征上有一定差異，NPM1突變、CEBPA雙突變可作為預(yù)后良好指標(biāo)，F(xiàn)LT3-ITD突變、C-KIT-D861V可作為預(yù)后不良指標(biāo)，通過檢查四項基因突變情況，可以為臨床預(yù)后判斷及治療提供參考。

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（收稿日期：2018-06-12 本文編輯：祁海文）