劉緒平 張文婷▲ 肖欽欽 李景蓮

1.江西省藥品檢驗檢測研究院 江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西南昌 330029；2.江西省醫(yī)療器械檢測中心，江西南昌 330029

《中國藥典》2015年版對微生物限度檢查法在前版的基礎(chǔ)上做了較大的修訂，包括國內(nèi)已生產(chǎn)的常用輔料要求做微生物限度檢查[1]。苯扎氯銨為氯化二甲基芐基烴銨的混合物，白色蠟狀固體或黃色膠狀體；水溶液顯中性或弱堿性反應(yīng)，振搖時產(chǎn)生多量泡沫。本品在水或乙醇中極易溶解，在乙醚中微溶。苯扎氯銨是一種陽離子表面活性劑，屬非氧化性殺菌劑，具有廣譜、高效的殺菌能力，在眼用制劑中苯扎氯銨是應(yīng)用最廣泛的防腐劑之一，常用濃度是0.01%～0.02%（W/V），常與其他抗菌劑或賦形劑聯(lián)合應(yīng)用，以增強抑制綠膿桿菌性，還可用于醫(yī)藥工業(yè)中潔凈區(qū)地面、臺面的表面消毒[2-4]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電子天平 YP601N（上海精科儀器有限公司）；生物安全柜1384 4’BSC（美國賽默飛世爾科技有限公司）；Htysteritest 601 型集菌儀（溫州維科生物實驗設(shè)備有限公司）；KB400霉菌培養(yǎng)箱（德國BINDER公司）。

1.2 試藥

苯扎氯銨：批號 20151116、20151119、2015123，生產(chǎn)單位：江西阿爾法高科藥業(yè)有限公司。培養(yǎng)基和試劑胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號：160330）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號：160310）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號：160602）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號：160602）等均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 微生物計數(shù)法的方法適用性試驗

2.1.1 實驗菌株菌液制備 接種金黃色葡萄球菌至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基于35℃下培養(yǎng)22h，并用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍梯度稀釋至10-4。另外三株細(xì)菌同法制備。

表1 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果

接種白色念珠菌至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基于25℃培養(yǎng)48h，用0.9% 無菌氯化鈉溶液10倍梯度稀釋至10-2。接種黑曲霉至沙氏葡萄糖瓊脂斜面上，25℃下培養(yǎng)7d，用含0.05%吐溫80 的0.9%無菌氯化鈉溶液5mL洗脫斜面上的孢子，用上述稀釋液10倍梯度稀釋至10-3。

2.1.2 供試液制備 取供試品10mL，加45℃的含10%的吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，置振蕩器上搖勻，作為1：10供試液。

2.1.3 試驗組

2.1.3.1 需氧菌計數(shù) 取1：10供試液1mL，薄膜過濾，每筒用含3%吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，總沖洗量為800mL/筒，每次100mL，將不大于100 cfu的實驗菌（3株細(xì)菌、2株真菌）加入到最后一次沖洗液中，濾干，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂平板上，置35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3株細(xì)菌培養(yǎng)3d，2株真菌分別培養(yǎng)5d，逐日觀察平板生長情況。

2.1.3.2 霉菌和酵母菌總數(shù) 試驗操作同2.1.3.1，沖洗量為300mL，加入的陽性菌為2株真菌，培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖瓊脂脂平板，25℃培養(yǎng)5d。

2.1.4 供試品對照組 取上述1：10供試液，薄膜過濾，操作同試驗組，不加入試驗菌，測定供試液本底菌數(shù)。

2.1.5 菌液對照組 取不含中和劑的稀釋液替代供試液，同試驗組操作加，測定加入的陽性菌數(shù)。

2.1.6 中和劑對照組 取含3%吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，同試驗組操作[5-8]。以上試驗結(jié)果見表1～2。

表2 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果

2.2 控制菌檢查方法的適用性實驗

2.2.1 大腸埃希菌

2.2.1.1 試驗組 取上述1：10 供試液10mL，薄膜過濾，用含3%吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，總沖洗量為300mL/筒，每次100mL，將小于100 cfu的大腸埃希菌加入到在最后一次沖洗液中，35℃培養(yǎng)24h，取上述培養(yǎng)物1mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)24h。將上述培養(yǎng)物劃線接種至麥康凱瓊脂平板上，35℃培養(yǎng) 48h，觀察平板生長情況。

2.2.1.2 陰性對照組 取稀釋液10mL照“2.2.1.1”項下方法操作。

2.2.2 金黃色葡萄球菌檢查

2.2.2.1 試驗組 操作同大腸埃希菌檢查試驗組，加入小于100 cfu的金黃色葡萄球菌，選擇性平板為甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板。

2.2.2.2 陰性對照組 取稀釋液 10 mL照“2.2.2.1”項下方法操作。

2.2.3 銅綠假單胞菌檢查法

2.2.3.1 試驗組 同大腸埃希菌檢查試驗組，加入小于100 cfu的銅綠假單胞菌，選擇性平板為溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板。

2.2.3.2 陰性對照組 取稀釋液 10 mL照“2.2.3.1”項下方法操作[9-11]。

三株控制菌檢查適用性試驗結(jié)果試驗組均檢出相應(yīng)的陽性菌，陰性對照組均無菌生長。

3 討論

3.1 藥用輔料的標(biāo)準(zhǔn)越來越嚴(yán)格

我們?nèi)粘Ｊ褂玫乃幤肥怯伤幱幂o料和主藥組成的，這兩類物質(zhì)全程參與了體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄過程，可以這樣說，過程的安全性決定著藥品最終的安全性，所以藥用輔料的安全性至關(guān)重要。我國藥用輔料的管理遠(yuǎn)不如藥品管理嚴(yán)格。藥用輔料國家規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)較少，而地方級標(biāo)準(zhǔn)較多，標(biāo)準(zhǔn)亦不夠完善。這直接影響著藥用輔料的管理和使用?！吨袊幍洹纷?977年開始收載輔料，品種逐漸增加[12-14]?！吨袊幍洹?015年版藥用輔料單獨收載在四部，質(zhì)量要求和安全性控制更加嚴(yán)格。在微生物限度檢查方面，制劑通則就明確規(guī)定了藥用輔料必須做微生物限度檢查，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定需氧菌總數(shù)不得過103（cfu/g或cfu/mL），霉菌和酵母菌總數(shù)不得過102（cfu/g或cfu/mL），控制菌檢查項目未做統(tǒng)一規(guī)定。

3.2 中和劑的選擇

苯扎氯銨屬于非氧化性殺菌劑，具有廣譜、高效的殺菌能力?？紤]普通方法不能消除其抑菌性，故而采用薄膜過濾法進(jìn)行實驗，選取敏感菌株金黃色葡萄球菌進(jìn)行預(yù)實驗，沖洗液為pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，當(dāng)沖洗量為500mL/筒時，回收比值為0；沖洗量為800mL/筒時，回收比值仍然為0。由于本品抑菌性太強，考慮使用中和劑消除供試品的抑菌性。由于本品為季銨類化合物所以選擇添加3%濃度的聚山梨酯80，當(dāng)沖洗量為500mL/筒時，回收比值仍然為0，沖洗量為800mL/筒時，3株細(xì)菌和2株真菌的回收比值均能達(dá)到藥典要求。最終我們確定該品種好氧菌檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查均采用薄膜過濾法，沖洗液為含3%吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液，沖洗量分別為800mL/筒和300mL/筒[15]。控制菌檢查項目藥典未做統(tǒng)一規(guī)定。苯扎氯胺作為藥用輔料是滴眼劑經(jīng)常使用的消毒劑：典型的濃度范圍為0.004%～0.01%。因其具有表面活性劑的功能，可以溶解淚膜的脂質(zhì)以及增加藥物滲透性，使其成為滴眼劑有用的賦形劑。故而控制菌檢查選擇大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌三個檢查項目。方法均為薄膜過濾法，沖洗液同好氧菌檢查，沖洗量均為300mL/筒。