陳仙梅 郭碩 袁麗

摘 要：目的 應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)高發(fā)區(qū)賁門癌前病變及早癌血清中相關(guān)差異蛋白，并利用ExPasy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相關(guān)差異蛋白峰，探討差異蛋白峰與在腫瘤發(fā)生相關(guān)性。方法 收集來(lái)自高發(fā)區(qū)經(jīng)病理證實(shí)的血清標(biāo)本259例，其中53例LGIN組，89例HGIN組，60例IGCA組和57例NOR組，采用弱陽(yáng)離子交換納米磁珠對(duì)血清蛋白進(jìn)行純化，MALDI-TOF-MS質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 三組病變組與NOR組比較以及各組間比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異蛋白峰193個(gè)，其中由15個(gè)差異蛋白峰1025、1190、1212、1315、1547、1561、1612、3452、3518、4485、5527、7992、8712、14063、33313建立的診斷模型為最優(yōu)診斷模型。該模型對(duì)賁門癌前病變及癌的特異性為100.00%，LGIN的靈敏度100.00%，HGIN的靈敏度85.25%，IGCA的靈敏度93.94%。結(jié)論 采用MALDI-TOF-MS聯(lián)合WCX建立診斷模型能夠有效區(qū)分各組病變，對(duì)高發(fā)區(qū)自然人群初篩工作有一定的應(yīng)用臨床價(jià)值。推測(cè)賁門癌的發(fā)生起始于LGIN或更早，但并不是所有的LGIN均發(fā)生癌變。對(duì)于表達(dá)與腫瘤相關(guān)差異蛋白峰的個(gè)體，需要給予內(nèi)鏡等干預(yù)措施。質(zhì)譜技術(shù)為高發(fā)區(qū)早期癌及癌前病變初篩及腫瘤發(fā)生學(xué)研究提供一條新的思路。

關(guān)鍵詞：賁門癌；癌前病變；MALDI-TOF-MS；蛋白質(zhì)組學(xué)

中圖分類號(hào)：R735 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.23.020

文章編號(hào)：1006-1959（2018）23-0072-04

Abstract：Objective MALDI-TOF-MS technique was used to detect the relevant differentially expressed proteins in the serum of precardia and early cancer in high incidence areas， and ExPasy database was used to search the related differentially expressed protein peaks to explore the correlation between differentially expressed protein peaks and tumorgenesis. Methods 259 pathologically confirmed serum samples were collected from the high-incidence areas， including 53 LGIN group， 89 HGIN group， 60 IGCA group and 57 NOR group. Serum proteins were purified by weak-cation exchange nano-magnetic beads and detected by MALDI-TOF-MS mass spectrometry. Results There were 193 statistically significant differentially expressed protein peaks in the pathological changes group， NOR group and each group， among which the optimal diagnostic model was established by 15 differentially expressed protein peaks： 1025， 1190， 1212， 1315， 1547， 1561， 1612， 3452， 3518， 4485， 5527， 7992， 8712， 14063 and 33313. The specificity of this model for precancerous lesions and cancers of cardia was 100.00%， the sensitivity of LGIN was 100.00%， the sensitivity of HGIN was 85.25%， and the sensitivity of IGCA was 93.94%. Conclusion MALDI-TOF-MS combined with WCX in the establishment of a diagnostic model can effectively distinguish between the groups of lesions， and has certain clinical value for the screening of natural population in high incidence areas. It is speculated that the occurrence of cardia cancer begins at LGIN or earlier， but not all LGIN cancers occur. Endoscopic and other interventions should be given to individuals expressing differentially expressed tumor-related protein peaks. Mass spectrometry provides a new idea for the early screening and tumorigenesis of early and precancerous lesions in high incidence areas.

Key words：Cardia cancer；Precancerous lesions；MALDI-TOF-MS；Proteomics

賁門癌（cardia cancer）是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，近年來(lái)全球遠(yuǎn)端胃癌發(fā)病呈下降趨勢(shì)，但是賁門癌的發(fā)病卻不斷上升[1]，目前其檢出方式主要依賴于內(nèi)鏡檢查，由于屬于侵入性診療方式，而且其對(duì)內(nèi)鏡醫(yī)生技術(shù)要求較高，難以用于與自然人群大規(guī)模普查，所以尋找特異性腫瘤標(biāo)志物，以縮小內(nèi)鏡篩查范圍，是目前所要解決的首要問(wèn)題。而傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物多存在特異性、敏感性低等缺點(diǎn)，難以廣泛應(yīng)用于臨床，因此，尋找新的特異性腫瘤標(biāo)志物顯得尤為重要。質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)之一，具高通量、高靈敏度、高特異性等傳統(tǒng)技術(shù)所不具備的優(yōu)點(diǎn)，能夠高效的檢測(cè)組織、體液微量樣本中的腫瘤相關(guān)低豐度蛋白。在眾多質(zhì)譜中，MALDI已廣泛用于肝癌[2]、食管癌[3]、前列腺癌[4]腫瘤蛋白分子研究，本研究應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）結(jié)合WCX磁珠技術(shù)平臺(tái)，檢測(cè)來(lái)自食管癌高發(fā)區(qū)內(nèi)鏡普查及活檢組織病理學(xué)證實(shí)的賁門腺上皮低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（low-grade intra pithelial neoplasia，LGIN）、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（high-grade intra epithelial neoplasia-intramucosal carcinoma，HGIN）、賁門癌（invasive gastric cardia adenocarcinoma，IGCA）和正常對(duì)照（Normal control，NOR），試圖為腫瘤高發(fā)區(qū)早期賁門癌及高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變?cè)\斷與臨床篩查探索一種新方法。

1資料與方法

1.1一般資料 血清樣本取自2010年～2011年河北磁縣、涉縣腫瘤內(nèi)鏡篩查人群及河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院內(nèi)鏡科來(lái)自高發(fā)區(qū)人群，NOR組取自同期該地區(qū)行內(nèi)鏡篩查的健康人群。本實(shí)驗(yàn)共收集標(biāo)本259例，其中NOR組57例，LGIN組53例，HGIN組89例，IGCA組60例，進(jìn)展期賁門癌患者采血前均未經(jīng)放療及化療，所有標(biāo)本排除肝炎、急性感染、自身免疫性疾病等影響血清蛋白表達(dá)的疾病。NOR組男性41例，女性16例，年齡43～76歲，平均年齡（58.70±7.26）歲。LGIN組男性49例，女性4例，年齡45～71歲，平均年齡（57.57±7.02）歲。HGIN組男性71例，女18例，年齡46～74歲，平均年齡（58.80±7.49）歲。IGCA組男性50例，女性10例，年齡45～75歲，平均年齡（61.22±7.74）歲。所有患者均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。隨機(jī)篩選156例標(biāo)本作為訓(xùn)練組，包括NOR組33例、LGIN組29例、HGIN組61例、IGCA組33例。剩余103例標(biāo)本作為盲法驗(yàn)證組，包括NOR組24例、LGIN組24例、HGIN組28例、IGCA組27例。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣本采集 每例樣本取材包括空腹靜脈血、病史（吸煙、飲酒、家族史、既往史）、知情同意書，檢查對(duì)象均排除急性感染、過(guò)敏、肝病、自身免疫性疾病等影響血清蛋白質(zhì)表達(dá)的疾病。

1.2.2樣品測(cè)定 質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置及數(shù)據(jù)采用MALDI（Biorad PBSⅡc）質(zhì)譜儀對(duì)制備好的樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，采用激光源強(qiáng)度為240，加速源電壓為20000 V，檢測(cè)器靈敏度為8，真空度為8.387e-007 Torr，掃描質(zhì)量范圍為0～50000 Da，收集次數(shù)為112次/每點(diǎn)，用Ciphergen Protein Chip軟件收集數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS l6.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，對(duì)各組進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)（P>0.1）、滿足正態(tài)性的蛋白進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)，不滿足條件的蛋白峰行非參數(shù)Kruskal-Wallis H test檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Biomarker Wizard TM和Biomarker Patterns TM Software軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，在整個(gè)質(zhì)譜圖中定量標(biāo)定出代表每種蛋白的波峰。

2結(jié)果

2.1建立賁門癌高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及粘膜內(nèi)癌診斷模型 應(yīng)用MB-WCX聯(lián)合MALDI-TOF-MS對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。隨機(jī)篩選其中156例樣本在低質(zhì)荷比范圍（0～50000 m/z）范圍內(nèi)檢測(cè)，在1000～50000 m/z內(nèi)全部可識(shí)別的差異蛋白峰有235個(gè)，共有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白峰193個(gè)（P<0.05）。

2.2利用BPS5.0建立指紋圖譜模型 用BPS分析這些差異蛋白，構(gòu)成診斷模型的15個(gè)蛋白峰分別為1025、1190、1212、1315、1547、1561、1612、3452、3518、4485、5527、7992、8712、14063、33313。各峰強(qiáng)度及P值，見(jiàn)表1。

2.3診斷模型的靈敏度及特異性 應(yīng)用產(chǎn)生樹形模型的源數(shù)據(jù)對(duì)該模型進(jìn)行的性能判斷，即對(duì)該模型學(xué)習(xí)能力的判斷。該模型檢驗(yàn)建立樣本所用的156例源數(shù)據(jù)，該模型對(duì)賁門癌前病變及癌的特異性為100.00%（33/33），LGIN的靈敏度100.00%（29/29），HGIN的靈敏度85.25%（52/61），IGCA的靈敏度93.94%（31/33）。為了驗(yàn)證上述模型的靈敏度和特異性，對(duì)該模型進(jìn)行盲法測(cè)試。擴(kuò)大樣本量，對(duì)未知的103例血清標(biāo)本進(jìn)行盲法預(yù)測(cè)，驗(yàn)證結(jié)果表明，對(duì)該模型對(duì)賁門癌前病變及癌的特異性為100.00%（24/24），LGIN的靈敏度100.00%（24/24），HGIN的靈敏度92.86%（26/28），IGCA的靈敏度92.59%（25/27），見(jiàn)表2。

3討論

MALDI-TOF-MS是近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型軟電離有機(jī)質(zhì)譜技術(shù)，其基本原理是將被測(cè)物分散在基質(zhì)分子當(dāng)中形成晶體，當(dāng)用一定強(qiáng)度的激光照射時(shí)，基質(zhì)分子從輻射中吸收能量，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)，然后對(duì)結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定[5，6]。我們[7]已應(yīng)用MALDI技術(shù)對(duì)高發(fā)區(qū)食管癌及正常對(duì)照組血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大量差異蛋白峰，對(duì)于早期食管癌及前病變的特異性為90.91%（30/33），對(duì)LGIN的靈敏度為100.00%（31/31），HGIN靈敏度為89.66%（52/58），AEC的靈敏度為81.26%（26/32）。Zhu D等[8]采用MALDI-TOF-MS對(duì)結(jié)腸癌患者血清進(jìn)行分析，在訓(xùn)練組中敏感性及特異性均為100.0%，在測(cè)試組中的敏感性為94.4%，特異性為75.5%。我們采用WCX結(jié)合MALDI-TOF-MS對(duì)容易獲得的血清標(biāo)本進(jìn)行純化分析，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后各組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白峰有194個(gè)。輸入BPS建立診斷模型，由15個(gè)蛋白峰組成的診斷模型該模型對(duì)賁門癌前病變及癌的特異性為100.00%（33/33），LGIN的靈敏度100.00%（29/29），HGIN的靈敏度85.246%（52/61），IGCA 的靈敏度93.93%（31/33）。另選103例血清標(biāo)本進(jìn)行盲法預(yù)測(cè)，驗(yàn)證結(jié)果表明，該模型對(duì)該模型對(duì)賁門癌前病變及癌的特異性為100.00%（24/24），LGIN的靈敏度100.00%（24/24），HGIN的靈敏度92.86%（26/28），IGCA的靈敏度92.59%（25/27）。該診斷模型能夠很好區(qū)分賁門癌發(fā)生過(guò)程的每個(gè)時(shí)期，而且取材簡(jiǎn)單方便、操作快捷，簡(jiǎn)便易行，自動(dòng)化程度高，5 min內(nèi)完成分析。方便用于賁門癌高發(fā)區(qū)自然人群初篩，降低內(nèi)鏡對(duì)大規(guī)模人群篩查的成本。

目前對(duì)于賁門癌發(fā)生的多階段演進(jìn)過(guò)程分子機(jī)制尚不清楚，本研究對(duì)BPS建模篩選出來(lái)的差異蛋白峰進(jìn)一步分析，其中1561、1612、7992、14063、1547、33313均自LGIN至IGCA呈高表達(dá)，1212、4485自LGIN至IGCA組均呈低表達(dá)，5527蛋白在高級(jí)別上皮內(nèi)開始升高，在浸潤(rùn)癌與HGIN組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說(shuō)明賁門癌發(fā)生過(guò)程中在LGIN時(shí)期一些與腫瘤相關(guān)的蛋白可能已發(fā)生改變，且與中晚期癌的變化無(wú)明顯差異。Yang J等[9]采用MALDI-TOF-MS及液相色譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組與胃癌患者之間存在49種差異蛋白，非轉(zhuǎn)移患者與轉(zhuǎn)移患者之間存在19種差異蛋白。因此，質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用使得我們發(fā)現(xiàn)更多與腫瘤相關(guān)未知蛋白，對(duì)于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展研究具有一定的幫助。

綜上所述，在癌前病變時(shí)期部分蛋白分子已經(jīng)發(fā)生改變，對(duì)尋找賁門癌及癌前病變的腫瘤標(biāo)志物具有重要意義，對(duì)于大量未知蛋白，我們有必要下一步準(zhǔn)備對(duì)差異蛋白質(zhì)荷比峰進(jìn)行分離、純化鑒定，將會(huì)進(jìn)一步增加本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团R床應(yīng)用的可行性，同時(shí)也為篩選賁門癌新的腫瘤標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。

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收稿日期：2018-9-12；修回日期：2018-9-20

編輯/雷華