李苑華 莊燕妍 黃嫻嫻 陳文穎 黃鳳婷 張世能

中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院消化內科(510120)

背景：XPO1(exportin 1)是核質轉運的重要介質之一，在多種人類惡性腫瘤中表達增高，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展進程，是惡性腫瘤的潛在治療靶點。目的：探討XPO1在人胰腺癌細胞中的表達、定位以及XPO1抑制劑KPT-330對腫瘤細胞增殖和凋亡的影響。方法：以蛋白質印跡法檢測6株人胰腺癌細胞株和2株人永生化正常胰腺導管上皮細胞株中的XPO1表達，選擇XPO1表達量最高的人胰腺癌細胞株MIA PaCa-2進行后續(xù)實驗。予MIA PaCa-2細胞不同濃度KPT-330(0.03、0.3、3 μmol/L)或DMSO處理，免疫熒光實驗檢測XPO1在細胞中的分布，CCK-8實驗和克隆形成實驗檢測細胞增殖，流式細胞分析檢測細胞周期和細胞凋亡，蛋白質印跡法檢測XPO1和凋亡相關蛋白caspase-3、PARP表達變化。結果：XPO1主要聚集分布于MIA PaCa-2細胞的核膜，經KPT-330處理后，XPO1的核膜高聚現象消失。與DMSO組相比，KPT-330可抑制MIA PaCa-2細胞的XPO1表達，并能抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，作用呈濃度依賴性。機制研究顯示KPT-330可誘導MIA PaCa-2細胞發(fā)生細胞周期S期阻滯，上調cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表達。結論：XPO1抑制劑KPT-330可能通過調節(jié)細胞周期分布、誘導細胞凋亡而抑制人胰腺癌細胞增殖。

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，5年生存率約為6%，中位生存期僅約6個月。根據美國癌癥協會最新發(fā)布的數據，2018年美國胰腺癌新發(fā)病例數將達到55 440例，死亡病例數約44 330例，死亡率占年發(fā)病率的80%[1]。我國流行病學資料顯示中國胰腺癌發(fā)病率呈上升趨勢[2]。胰腺癌早期診斷困難，大多數患者確診時已出現轉移性病變，根治性手術率低，迄今吉西他濱仍為一線化療藥物，然而因耐藥性和毒性反應致臨床療效有限[3]。探索新的治療靶點和治療策略將有助于改善胰腺癌患者的預后。

mRNA和特定蛋白質的核質轉運是細胞內信號轉導的關鍵步驟，參與細胞增殖、凋亡等生命活動[4]。XPO1(exportin 1)是核質轉運的重要介質之一，主要參與介導細胞內物質如相對分子質量大于40 kDa(1 Da=0.992 1 u)的蛋白質分子和部分mRNA、rRNA、U-snRNA等的出核[5-7]。研究發(fā)現XPO1在卵巢癌、神經膠質瘤、骨肉瘤、胰腺癌、宮頸癌等多種人類惡性腫瘤中表達增高，可通過多種機制介導腫瘤細胞增殖，因此靶向XPO1的核運輸機制成為一些惡性腫瘤的潛在治療靶點[7]。KPT-330(又稱selinexor)是一種人工合成的新型小分子高效口服XPO1抑制劑，目前已在血液系統腫瘤和實體瘤中進行Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗[7-8]。既往文獻報道高表達XPO1的胰腺癌患者預后較差[9]。本文旨在探討XPO1在人胰腺癌細胞中的表達、定位以及KPT-330對人胰腺癌細胞增殖和凋亡的影響，為臨床應用XPO1抑制劑治療胰腺癌奠定實驗基礎。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

人永生化正常胰腺導管上皮細胞株hTERT-HPNE和6株人胰腺癌細胞株(PANC-1、SW1990、MIA PaCa-2、BxPC-3、HPAF-Ⅱ、Capan-2)購自中科院上海細胞庫，人永生化正常胰腺導管上皮細胞株H6C7由加拿大安大略癌癥研究所Ming-Sound Tsao教授惠贈，體外培養(yǎng)傳代。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、RIPA裂解液、PVDF膜、牛血清白蛋白(BSA)、EMD MilliporeTMImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate(ECL超敏發(fā)光液)(Thermo Fisher Scientific Inc.)；KPT-330(Selleck.cn)；DMSO(MP Biomedicals,LLC.)；小鼠XPO1單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology)；山羊抗小鼠IgG、DAPI染液(北京中杉金橋生物技術有限公司)；Caspase-3、cleaved-caspase-3、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)、cleaved-PARP、β-tubulin抗體和相應二抗(Cell Signaling Technology,Inc.)；CCK-8細胞增殖、細胞毒性檢測試劑盒(同仁化學研究所)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(Bender Inc.)；細胞周期檢測試劑盒(碧云天生物技術)；細胞培養(yǎng)耗材(Corning Incorporated)。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：MIA PaCa-2細胞使用DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2～3 d換液或傳代1次，0.02% EDTA與0.25%胰蛋白酶1∶1混合消化，完全培養(yǎng)基中和。

2.實驗分組和藥物處理：5 mg KPT-330以1.128 4 mL DMSO稀釋為10 mmol/L的儲存液，使用時以培養(yǎng)基稀釋至相應濃度。實驗設置4個組別：DMSO組、KPT-330 0.03 μmol/L組、KPT-330 0.3 μmol/L 組和KPT-330 3 μmol/L組。MIA PaCa-2細胞常規(guī)培養(yǎng)，待融合至80%～90%時傳代，以2×105/孔接種于6孔板，待融合至60%～70%時，將培養(yǎng)基分別更換為含DMSO和含0.03、0.3、3 μmol/L KPT-330的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)所需時長。

3.蛋白質印跡法：各株細胞株培養(yǎng)48 h，各組MIA PaCa-2細胞以含DMSO或相應濃度KPT-330的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取總蛋白30 μg上樣，恒壓濃縮膠60 V、分離膠100 V電泳約90 min，4 ℃ 200 mA轉膜 120 min，室溫漂洗轉印后的PVDF膜3次×10 min，5% BSA室溫封閉1.5 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，1×TBST洗膜3次×10 min，加入二抗室溫孵育 2 h，1×TBST洗膜3次×10 min，ECL超敏發(fā)光液顯色，ImageJ軟件分析、計算目的蛋白相對表達量。實驗獨立重復3次。

4.免疫熒光實驗：各組MIA PaCa-2細胞以4×103/孔接種于已放置10 mm細胞爬片的24孔板，24 h 后分別加入含DMSO或相應濃度KPT-330的培養(yǎng)基，48 h后于培養(yǎng)板中以PBS洗玻片3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，0.5% Triton X-100(PBS配制)室溫通透 20 min，PBS洗3次，正常山羊血清室溫封閉 30 min，加入一抗4 ℃ 孵育過夜，PBST洗3次，加入熒光二抗20～37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，加入DAPI避光孵育 5 min，抗熒光淬滅封片液封片，共聚焦顯微鏡觀察、拍照。

5.CCK-8實驗：各組MIA PaCa-2細胞以4×103/孔(100 μL)接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后分別加入含DMSO或相應濃度KPT-330的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后棄培養(yǎng)基，加入含10% CCK-8的培養(yǎng)基，3 h后于酶聯免疫檢測儀450 nm波長處測定吸光度(A)值，以未接種細胞、僅加入培養(yǎng)基和CCK-8的空白孔調零。實驗獨立重復3次，每組設5個復孔。

6.平板克隆形成實驗：各組MIA PaCa-2細胞以4×103/孔接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)9 d后，分別以含DMSO或相應濃度KPT-330的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色20 min。以PBS洗去殘余染料，自然干燥后拍照，ImageJ軟件分析、計算相對克隆數。實驗獨立重復3次。

7.流式細胞分析：各組MIA PaCa-2細胞以含DMSO或相應濃度KPT-330的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，以PBS重懸為(1～5)×106/L的細胞懸液，取0.5 mL立即用于細胞凋亡檢測，0.5 mL用于細胞周期檢測，操作嚴格按試劑盒說明書進行。實驗獨立重復3次。

三、統計學分析

結 果

一、XPO1在人胰腺癌細胞中的表達

蛋白質印跡法檢測顯示，與人永生化正常胰腺導管上皮細胞株H6C7、hTERT-HPNE相比，人胰腺癌細胞株MIA PaCa-2、Capan-2、PANC-1、SW1990中的XPO1表達明顯升高，以MIA PaCa-2細胞升高最為顯著(圖1)，故選擇該細胞株作為研究對象進行后續(xù)實驗。

二、XPO1在MIA PaCa-2細胞中的分布

免疫熒光實驗觀察到，XPO1主要聚集分布于MIA PaCa-2細胞的核膜，經KPT-330處理48 h，XPO1的核膜高聚現象消失(圖2)。

圖1 XPO1在人胰腺癌細胞中的表達

圖2 XPO1在MIA PaCa-2細胞中的分布

三、KPT-330對MIA PaCa-2細胞增殖和凋亡的影響

CCK-8實驗顯示，培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，經KPT-330處理的MIA PaCa-2細胞A值均較同時間點DMSO組降低，KPT-330濃度越高，A值降低越為明顯(圖3A)。平板克隆形成實驗亦顯示，與DMSO組相比，隨著KPT-330濃度的增高，形成的細胞克隆數逐漸減少(圖3B)。

流式細胞分析顯示，與DMSO組相比，經KPT-330處理的MIA PaCa-2細胞出現凋亡峰，隨著KPT-330濃度的增高，細胞凋亡率逐漸升高(圖3C)。蛋白質印跡法檢測進一步證實，與 DMSO組相比，隨著KPT-330濃度的增高，XPO1表達呈下降趨勢，凋亡相關蛋白 cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表達逐漸升高(圖3D)。

上述結果提示，KPT-330可抑制MIA PaCa-2細胞增殖，誘導細胞凋亡，作用呈濃度依賴性。

圖3 KPT-330對MIA PaCa-2細胞增殖和凋亡的影響

四、KPT-330對MIA PaCa-2細胞細胞周期的影響

流式細胞分析顯示，與DMSO組相比，隨著KPT-330濃度的增高，MIA PaCa-2細胞G1期細胞比例逐漸降低，G2期細胞比例無明顯變化，S期細胞比例逐漸升高，結合CCK-8實驗結果，提示KPT-330可誘導MIA PaCa-2細胞發(fā)生細胞周期S期阻滯(圖4)。

討 論

在多種人類惡性腫瘤中，XPO1異常表達可致多個腫瘤抑制蛋白如Rb、APC、p53、BRAC1、FOXO以及分子伴侶蛋白Hsp90等在細胞內分布異常，從而影響細胞分化、增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學行為，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展進程[10]。XPO1介導的出核運動具有特異性，其主要轉運含有核輸出信號(nuclear export signal,NES)的蛋白出核。NES是一段富含亮氨酸的序列，其所含的疏水殘基能與XPO1結合，而XPO1抑制劑則能與含NES的蛋白競爭結合XPO1的疏水性凹槽結構(疏水活性口袋)中的活性Cys528位點，從而抑制出核運動[11-13]。

萊普霉素B(leptomycin B)是第一個被發(fā)現的天然XPO1特異性抑制劑[14]，隨后研究者相繼發(fā)現了大量XPO1天然抑制劑，如ratjadone類似物、anguinomycin類似物等[15-16]。然而，天然抑制劑對XPO1的抑制效果不一且不良反應較大，臨床應用受到限制。KPT-185和KPT-276是人工合成的XPO1不可逆性抑制劑，具有良好的抗血液系統腫瘤效應[17]。在實體瘤中，人工合成XPO1抑制劑同樣顯示出明顯的抗腫瘤效應。在K-ras基因突變非小細胞肺癌中，XPO1抑制劑能顯著抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡[18]；在前列腺癌細胞中，XPO1抑制劑可抑制腫瘤細胞生長、遷移、侵襲，顯著延長荷瘤動物模型的生存期[19]。在胰腺癌中，XPO1抑制劑亦有明顯的抑癌作用。胰腺癌組織中XPO1表達顯著增高，并與血清腫瘤標記物CEA、CA19-9水平、淋巴結轉移和肝轉移以及患者預后不良顯著相關[9]。在胰腺癌細胞以及裸鼠皮下和原位移植瘤模型中，XPO1抑制劑可顯著抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤生長，誘導腫瘤細胞凋亡[20]，其機制可能與促進具有促凋亡作用的腫瘤抑制蛋白PAR-4表達并在核內聚集有關[20-21]。近年研究[22]發(fā)現新一代XPO1抑制劑KPT-330能增強胰腺癌對吉西他濱的化療敏感性。因此，進一步探索XPO1在胰腺癌中的表達以及KPT-330對胰腺癌細胞生物學行為的影響具有重要意義。

本研究首先采用蛋白質印跡法檢測XPO1在人永生化正常胰腺導管上皮細胞株hTERT-HPNE、H6C7和6株人胰腺癌細胞株中的表達，結果顯示與hTERT-HPNE、H6C7細胞相比，XPO1在人胰腺癌細胞株MIA PaCa-2、Capan-2、PANC-1、SW1990中呈高表達，提示XPO1異常高表達或與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展存在密切聯系。其次，通過免疫熒光實驗可觀察到XPO1主要聚集分布于MIA PaCa-2細胞的核膜，而XPO1抑制劑KPT-330處理可使XPO1核膜高聚現象消失。體外功能實驗顯示，與DMSO組相比，隨著KPT-330濃度的增高，MIA PaCa-2細胞XPO1表達呈下降趨勢，發(fā)生細胞周期S期阻滯，細胞增殖明顯受抑并出現凋亡峰，凋亡相關蛋白cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表達升高，提示KPT-330可下調人胰腺癌細胞XPO1表達，抑制人胰腺癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，作用隨藥物濃度的增高而增強，這一效應可能與其誘導腫瘤細胞細胞周期阻滯有關。

綜上所述，XPO1在多種人胰腺癌細胞株中呈高表達，其異常高表達或與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。XPO1新型抑制劑KPT-330可下調胰腺癌細胞中的XPO1表達，調節(jié)細胞周期分布，誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖。后續(xù)擬繼續(xù)開展相關體內實驗以驗證XPO1抑制劑抑制胰腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉移的作用并探討其具體作用機制。

圖4 KPT-330對MIA PaCa-2細胞細胞周期的影響