李苑華 莊燕妍 黃嫻嫻 陳文穎 黃鳳婷 張世能

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科(510120)

背景：XPO1(exportin 1)是核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要介質(zhì)之一，在多種人類惡性腫瘤中表達(dá)增高，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，是惡性腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)。目的：探討XPO1在人胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)、定位以及XPO1抑制劑KPT-330對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法：以蛋白質(zhì)印跡法檢測6株人胰腺癌細(xì)胞株和2株人永生化正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株中的XPO1表達(dá)，選擇XPO1表達(dá)量最高的人胰腺癌細(xì)胞株MIA PaCa-2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。予MIA PaCa-2細(xì)胞不同濃度KPT-330(0.03、0.3、3 μmol/L)或DMSO處理，免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測XPO1在細(xì)胞中的分布，CCK-8實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞分析檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，蛋白質(zhì)印跡法檢測XPO1和凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、PARP表達(dá)變化。結(jié)果：XPO1主要聚集分布于MIA PaCa-2細(xì)胞的核膜，經(jīng)KPT-330處理后，XPO1的核膜高聚現(xiàn)象消失。與DMSO組相比，KPT-330可抑制MIA PaCa-2細(xì)胞的XPO1表達(dá)，并能抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，作用呈濃度依賴性。機(jī)制研究顯示KPT-330可誘導(dǎo)MIA PaCa-2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期S期阻滯，上調(diào)cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表達(dá)。結(jié)論：XPO1抑制劑KPT-330可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期分布、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制人胰腺癌細(xì)胞增殖。

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，5年生存率約為6%，中位生存期僅約6個(gè)月。根據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)最新發(fā)布的數(shù)據(jù)，2018年美國胰腺癌新發(fā)病例數(shù)將達(dá)到55 440例，死亡病例數(shù)約44 330例，死亡率占年發(fā)病率的80%[1]。我國流行病學(xué)資料顯示中國胰腺癌發(fā)病率呈上升趨勢[2]。胰腺癌早期診斷困難，大多數(shù)患者確診時(shí)已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性病變，根治性手術(shù)率低，迄今吉西他濱仍為一線化療藥物，然而因耐藥性和毒性反應(yīng)致臨床療效有限[3]。探索新的治療靶點(diǎn)和治療策略將有助于改善胰腺癌患者的預(yù)后。

mRNA和特定蛋白質(zhì)的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵步驟，參與細(xì)胞增殖、凋亡等生命活動(dòng)[4]。XPO1(exportin 1)是核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要介質(zhì)之一，主要參與介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)如相對(duì)分子質(zhì)量大于40 kDa(1 Da=0.992 1 u)的蛋白質(zhì)分子和部分mRNA、rRNA、U-snRNA等的出核[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)XPO1在卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨肉瘤、胰腺癌、宮頸癌等多種人類惡性腫瘤中表達(dá)增高，可通過多種機(jī)制介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖，因此靶向XPO1的核運(yùn)輸機(jī)制成為一些惡性腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)[7]。KPT-330(又稱selinexor)是一種人工合成的新型小分子高效口服XPO1抑制劑，目前已在血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體瘤中進(jìn)行Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)[7-8]。既往文獻(xiàn)報(bào)道高表達(dá)XPO1的胰腺癌患者預(yù)后較差[9]。本文旨在探討XPO1在人胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)、定位以及KPT-330對(duì)人胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為臨床應(yīng)用XPO1抑制劑治療胰腺癌奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

人永生化正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株hTERT-HPNE和6株人胰腺癌細(xì)胞株(PANC-1、SW1990、MIA PaCa-2、BxPC-3、HPAF-Ⅱ、Capan-2)購自中科院上海細(xì)胞庫，人永生化正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株H6C7由加拿大安大略癌癥研究所Ming-Sound Tsao教授惠贈(zèng)，體外培養(yǎng)傳代。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、RIPA裂解液、PVDF膜、牛血清白蛋白(BSA)、EMD MilliporeTMImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate(ECL超敏發(fā)光液)(Thermo Fisher Scientific Inc.)；KPT-330(Selleck.cn)；DMSO(MP Biomedicals,LLC.)；小鼠XPO1單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology)；山羊抗小鼠IgG、DAPI染液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Caspase-3、cleaved-caspase-3、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)、cleaved-PARP、β-tubulin抗體和相應(yīng)二抗(Cell Signaling Technology,Inc.)；CCK-8細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性檢測試劑盒(同仁化學(xué)研究所)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Bender Inc.)；細(xì)胞周期檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù))；細(xì)胞培養(yǎng)耗材(Corning Incorporated)。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：MIA PaCa-2細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2～3 d換液或傳代1次，0.02% EDTA與0.25%胰蛋白酶1∶1混合消化，完全培養(yǎng)基中和。

2.實(shí)驗(yàn)分組和藥物處理：5 mg KPT-330以1.128 4 mL DMSO稀釋為10 mmol/L的儲(chǔ)存液，使用時(shí)以培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)組別：DMSO組、KPT-330 0.03 μmol/L組、KPT-330 0.3 μmol/L 組和KPT-330 3 μmol/L組。MIA PaCa-2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，待融合至80%～90%時(shí)傳代，以2×105/孔接種于6孔板，待融合至60%～70%時(shí)，將培養(yǎng)基分別更換為含DMSO和含0.03、0.3、3 μmol/L KPT-330的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)所需時(shí)長。

3.蛋白質(zhì)印跡法：各株細(xì)胞株培養(yǎng)48 h，各組MIA PaCa-2細(xì)胞以含DMSO或相應(yīng)濃度KPT-330的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取總蛋白30 μg上樣，恒壓濃縮膠60 V、分離膠100 V電泳約90 min，4 ℃ 200 mA轉(zhuǎn)膜 120 min，室溫漂洗轉(zhuǎn)印后的PVDF膜3次×10 min，5% BSA室溫封閉1.5 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，1×TBST洗膜3次×10 min，加入二抗室溫孵育 2 h，1×TBST洗膜3次×10 min，ECL超敏發(fā)光液顯色，ImageJ軟件分析、計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

4.免疫熒光實(shí)驗(yàn)：各組MIA PaCa-2細(xì)胞以4×103/孔接種于已放置10 mm細(xì)胞爬片的24孔板，24 h 后分別加入含DMSO或相應(yīng)濃度KPT-330的培養(yǎng)基，48 h后于培養(yǎng)板中以PBS洗玻片3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，0.5% Triton X-100(PBS配制)室溫通透 20 min，PBS洗3次，正常山羊血清室溫封閉 30 min，加入一抗4 ℃ 孵育過夜，PBST洗3次，加入熒光二抗20～37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，加入DAPI避光孵育 5 min，抗熒光淬滅封片液封片，共聚焦顯微鏡觀察、拍照。

5.CCK-8實(shí)驗(yàn)：各組MIA PaCa-2細(xì)胞以4×103/孔(100 μL)接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后分別加入含DMSO或相應(yīng)濃度KPT-330的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后棄培養(yǎng)基，加入含10% CCK-8的培養(yǎng)基，3 h后于酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm波長處測定吸光度(A)值，以未接種細(xì)胞、僅加入培養(yǎng)基和CCK-8的空白孔調(diào)零。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

6.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：各組MIA PaCa-2細(xì)胞以4×103/孔接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)9 d后，分別以含DMSO或相應(yīng)濃度KPT-330的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min。以PBS洗去殘余染料，自然干燥后拍照，ImageJ軟件分析、計(jì)算相對(duì)克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

7.流式細(xì)胞分析：各組MIA PaCa-2細(xì)胞以含DMSO或相應(yīng)濃度KPT-330的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，以PBS重懸為(1～5)×106/L的細(xì)胞懸液，取0.5 mL立即用于細(xì)胞凋亡檢測，0.5 mL用于細(xì)胞周期檢測，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、XPO1在人胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，與人永生化正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株H6C7、hTERT-HPNE相比，人胰腺癌細(xì)胞株MIA PaCa-2、Capan-2、PANC-1、SW1990中的XPO1表達(dá)明顯升高，以MIA PaCa-2細(xì)胞升高最為顯著(圖1)，故選擇該細(xì)胞株作為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

二、XPO1在MIA PaCa-2細(xì)胞中的分布

免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到，XPO1主要聚集分布于MIA PaCa-2細(xì)胞的核膜，經(jīng)KPT-330處理48 h，XPO1的核膜高聚現(xiàn)象消失(圖2)。

圖1 XPO1在人胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 XPO1在MIA PaCa-2細(xì)胞中的分布

三、KPT-330對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，經(jīng)KPT-330處理的MIA PaCa-2細(xì)胞A值均較同時(shí)間點(diǎn)DMSO組降低，KPT-330濃度越高，A值降低越為明顯(圖3A)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)亦顯示，與DMSO組相比，隨著KPT-330濃度的增高，形成的細(xì)胞克隆數(shù)逐漸減少(圖3B)。

流式細(xì)胞分析顯示，與DMSO組相比，經(jīng)KPT-330處理的MIA PaCa-2細(xì)胞出現(xiàn)凋亡峰，隨著KPT-330濃度的增高，細(xì)胞凋亡率逐漸升高(圖3C)。蛋白質(zhì)印跡法檢測進(jìn)一步證實(shí)，與 DMSO組相比，隨著KPT-330濃度的增高，XPO1表達(dá)呈下降趨勢，凋亡相關(guān)蛋白 cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表達(dá)逐漸升高(圖3D)。

上述結(jié)果提示，KPT-330可抑制MIA PaCa-2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，作用呈濃度依賴性。

圖3 KPT-330對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

四、KPT-330對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞分析顯示，與DMSO組相比，隨著KPT-330濃度的增高，MIA PaCa-2細(xì)胞G1期細(xì)胞比例逐漸降低，G2期細(xì)胞比例無明顯變化，S期細(xì)胞比例逐漸升高，結(jié)合CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示KPT-330可誘導(dǎo)MIA PaCa-2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期S期阻滯(圖4)。

討 論

在多種人類惡性腫瘤中，XPO1異常表達(dá)可致多個(gè)腫瘤抑制蛋白如Rb、APC、p53、BRAC1、FOXO以及分子伴侶蛋白Hsp90等在細(xì)胞內(nèi)分布異常，從而影響細(xì)胞分化、增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程[10]。XPO1介導(dǎo)的出核運(yùn)動(dòng)具有特異性，其主要轉(zhuǎn)運(yùn)含有核輸出信號(hào)(nuclear export signal,NES)的蛋白出核。NES是一段富含亮氨酸的序列，其所含的疏水殘基能與XPO1結(jié)合，而XPO1抑制劑則能與含NES的蛋白競爭結(jié)合XPO1的疏水性凹槽結(jié)構(gòu)(疏水活性口袋)中的活性Cys528位點(diǎn)，從而抑制出核運(yùn)動(dòng)[11-13]。

萊普霉素B(leptomycin B)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的天然XPO1特異性抑制劑[14]，隨后研究者相繼發(fā)現(xiàn)了大量XPO1天然抑制劑，如ratjadone類似物、anguinomycin類似物等[15-16]。然而，天然抑制劑對(duì)XPO1的抑制效果不一且不良反應(yīng)較大，臨床應(yīng)用受到限制。KPT-185和KPT-276是人工合成的XPO1不可逆性抑制劑，具有良好的抗血液系統(tǒng)腫瘤效應(yīng)[17]。在實(shí)體瘤中，人工合成XPO1抑制劑同樣顯示出明顯的抗腫瘤效應(yīng)。在K-ras基因突變非小細(xì)胞肺癌中，XPO1抑制劑能顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]；在前列腺癌細(xì)胞中，XPO1抑制劑可抑制腫瘤細(xì)胞生長、遷移、侵襲，顯著延長荷瘤動(dòng)物模型的生存期[19]。在胰腺癌中，XPO1抑制劑亦有明顯的抑癌作用。胰腺癌組織中XPO1表達(dá)顯著增高，并與血清腫瘤標(biāo)記物CEA、CA19-9水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后不良顯著相關(guān)[9]。在胰腺癌細(xì)胞以及裸鼠皮下和原位移植瘤模型中，XPO1抑制劑可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤生長，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[20]，其機(jī)制可能與促進(jìn)具有促凋亡作用的腫瘤抑制蛋白PAR-4表達(dá)并在核內(nèi)聚集有關(guān)[20-21]。近年研究[22]發(fā)現(xiàn)新一代XPO1抑制劑KPT-330能增強(qiáng)胰腺癌對(duì)吉西他濱的化療敏感性。因此，進(jìn)一步探索XPO1在胰腺癌中的表達(dá)以及KPT-330對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響具有重要意義。

本研究首先采用蛋白質(zhì)印跡法檢測XPO1在人永生化正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株hTERT-HPNE、H6C7和6株人胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)，結(jié)果顯示與hTERT-HPNE、H6C7細(xì)胞相比，XPO1在人胰腺癌細(xì)胞株MIA PaCa-2、Capan-2、PANC-1、SW1990中呈高表達(dá)，提示XPO1異常高表達(dá)或與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系。其次，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)可觀察到XPO1主要聚集分布于MIA PaCa-2細(xì)胞的核膜，而XPO1抑制劑KPT-330處理可使XPO1核膜高聚現(xiàn)象消失。體外功能實(shí)驗(yàn)顯示，與DMSO組相比，隨著KPT-330濃度的增高，MIA PaCa-2細(xì)胞XPO1表達(dá)呈下降趨勢，發(fā)生細(xì)胞周期S期阻滯，細(xì)胞增殖明顯受抑并出現(xiàn)凋亡峰，凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表達(dá)升高，提示KPT-330可下調(diào)人胰腺癌細(xì)胞XPO1表達(dá)，抑制人胰腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，作用隨藥物濃度的增高而增強(qiáng)，這一效應(yīng)可能與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。

綜上所述，XPO1在多種人胰腺癌細(xì)胞株中呈高表達(dá)，其異常高表達(dá)或與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。XPO1新型抑制劑KPT-330可下調(diào)胰腺癌細(xì)胞中的XPO1表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期分布，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。后續(xù)擬繼續(xù)開展相關(guān)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證XPO1抑制劑抑制胰腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的作用并探討其具體作用機(jī)制。

圖4 KPT-330對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞細(xì)胞周期的影響