陳 立 王承黨

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科 消化系病研究室(350005)

背景：糞菌移植(FMT)能減輕炎癥性腸病(IBD)患者腸黏膜炎癥、改善臨床癥狀，但具體作用機制尚未明確。目的：探討FMT對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠內(nèi)臟敏感性的影響。方法：小鼠飲用2.0% DSS溶液制備結(jié)腸炎模型。將40只C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組(A組)、模型對照組(B組)、雙歧桿菌三聯(lián)活菌組(C組)、糞便濾液組(D組)，分別給予0.9% NaCl溶液、0.9% NaCl溶液、雙歧桿菌三聯(lián)活菌液、糞便濾液灌腸。計算小鼠疾病活動指數(shù)(DAI)、結(jié)腸組織病理學(xué)評分；測定不同結(jié)直腸擴張(CRD)容積時腹壁肌電幅值變化；免疫組化法測定腰骶髓P物質(zhì)(SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)表達。結(jié)果：B組小鼠DAI、結(jié)腸組織病理學(xué)評分和腰骶髓SP表達明顯高于A組、C組和D組(P<0.05)；而A、C、D三組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。擴張容積為0.04、0.06、0.08 mL時，B組腹壁肌電幅值顯著高于A組、C組和D組(P<0.05)，且與SP表達之間存在正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。四組小鼠腰骶髓CGRP表達相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：FMT可改善結(jié)腸炎小鼠的內(nèi)臟敏感性、減少腰骶髓SP表達，其降低內(nèi)臟敏感性的作用可能與抑制脊髓背角SP表達有關(guān)。

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)常表現(xiàn)為反復(fù)腹痛、腹瀉、黏液膿血便等，部分緩解期IBD患者也常出現(xiàn)腹痛、排便異常等腸易激綜合征(IBS)樣癥狀[1]，內(nèi)臟高敏感被認為是IBD和IBS患者相關(guān)疼痛癥狀的主要病理生理機制[2-3]。處于緩解期甚至黏膜已愈合的IBD患者出現(xiàn)IBS樣癥狀是提示還存在炎癥活動還是合并IBS，這一問題目前仍不明確。臨床上需一種治療措施既可拮抗腸道炎癥又能減輕處于疾病活動期或緩解期患者的臨床癥狀(無論是由炎癥活動還是合并功能性疾病引起)。糞菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT)是一種將健康人的糞便以混懸液方式通過一定途徑輸入至患病個體腸道內(nèi)以恢復(fù)或補充正常腸道菌群，從而實現(xiàn)疾病治療目的的治療手段[4]。FMT可用于治療IBD，但具體作用機制仍處于研究探討中。本研究通過葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)建立小鼠結(jié)腸炎模型并給予糞便濾液灌腸治療，旨在探討FMT對內(nèi)臟敏感性的影響及其可能機制，從而為IBD的臨床診治提供一定的依據(jù)。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物：雄性清潔級健康C57BL/6小鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司。用混合配方飼料(由上海斯萊克實驗動物中心提供)喂養(yǎng)，自由進食飲水，每日更換飲水、飼料，定期更換墊料，保持小鼠生活環(huán)境通風(fēng)和清潔衛(wèi)生。

2.主要試劑與器材：DSS購自MP Biomedicals Inc,；雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊購自上海信誼藥廠有限公司；尿糞隱血試驗試劑購自南京建成生物工程研究所；濃縮型兔抗小鼠P物質(zhì)(SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，工作濃度分別為1∶100、1∶50；免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。多道生理信號采集系統(tǒng)(RM6240BD，成都儀器廠)；數(shù)字顯微攝像系統(tǒng)(Olympus公司)。

二、實驗方法

1.小鼠糞便濾液的制備：參照Cui等[5]的研究方法制作糞便濾液。

2.實驗動物分組和處理：隨機選取10只小鼠作為糞便供體組，余40只小鼠按1∶3的比例隨機分成正常對照組(A組，n=10)和模型組(n=30)。模型組小鼠參照Chassaing等[6]的方法自由飲用 2.0% DSS(w/w,20g/L)蒸餾水溶液7 d，誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎，然后改飲用蒸餾水；A組小鼠自由飲用蒸餾水。實驗第8天，將模型組隨機分為模型對照組(B組)、雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊組(C組)、糞便濾液組(D組)，每組各10只。實驗第11天，A、B組小鼠給予0.9% NaCl溶液灌腸(1.0 mL)，C組給予雙歧桿菌三聯(lián)活菌液灌腸(1.0 mL,0.255 g/kg)[7]，D組給予糞便濾液灌腸(1.0 mL,15.197 g/kg)[8]，2次/d，0.5 mL/次，間隔1 d，總共6次。灌腸治療結(jié)束2 d后，參照La等[9]和劉瑋等[10]的方法行結(jié)直腸擴張(CRD)，擴張容積為0.02、0.04、0.06、0.08 mL時測定小鼠腹外斜肌肌電。

3.疾病活動指數(shù)(DAI)[11]：每天觀察并記錄小鼠進食、飲水、精神、活動、排便等情況，稱重體質(zhì)量，計算DAI評分。

4.結(jié)腸組織病理學(xué)評分：CRD實驗結(jié)束后，用10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉小鼠，剖腹取病變明顯的遠端結(jié)腸，行病理學(xué)檢查并進行評分。正常腸黏膜，0分；黏膜層輕度炎癥和水腫，基底部1/3隱窩消失，1分；黏膜層中度炎癥，基底部2/3隱窩消失，2分；黏膜層中度炎癥，隱窩完全消失，但上皮層尚完整，3分；黏膜層、黏膜下層、肌層中度炎癥，隱窩和上皮層消失，4分[12]。每張切片隨機選取3個高倍視野，組織病理學(xué)評分取均值。

5.腰骶髓免疫組化染色：取腰膨大以下L6-S1脊髓節(jié)段，經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚切片。采用免疫組化SP法檢測SP和CGRP表達，具體步驟參照試劑盒說明書操作。每張切片隨機選取3個高倍視野，采用IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)進行計算，取均值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況和DAI評分

A組小鼠在整個實驗中毛色光整，反應(yīng)靈活，活動、進食、排便均正常，體質(zhì)量增加。模型組小鼠飲用2.0% DSS溶液后逐漸出現(xiàn)毛色不光整，反應(yīng)遲鈍，活動、進食減少，糞便呈糊狀，且次數(shù)增多，糞便隱血試驗陽性，第5天開始出現(xiàn)不同程度的體質(zhì)量下降，停用DSS后體質(zhì)量仍繼續(xù)下降；實驗第10天，即灌腸前1天C組和D組各有1只小鼠死亡，解剖發(fā)現(xiàn)結(jié)腸明顯充血、水腫、潰瘍。造模后，B組、C組、D組之間DAI相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。灌腸后，A組、C組、D組DAI均顯著均低于B組(P<0.05)，而這三組之間無明顯差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組小鼠DAI和結(jié)腸組織病理學(xué)評分比較

*與B組比較，P<0.05

二、結(jié)腸組織病理學(xué)評分

DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎組織學(xué)表現(xiàn)為腸黏膜上皮細胞間斷壞死脫落，大量炎癥細胞浸潤，多為中性粒細胞、淋巴細胞，間質(zhì)有輕微水腫，腺體排列基本規(guī)則；給予灌腸后，C組和D組腸組織損傷減輕(圖1)。A組、C組、D組組織病理學(xué)評分均顯著低于B組(P<0.05)，而這三組之間無明顯差異(P>0.05)(表1)。

三、小鼠腹壁肌電變化

各組小鼠腹壁肌電幅值隨著擴張容積的升高而增高。CRD容積為0.02 mL時，四組小鼠腹壁肌電幅值無明顯差異(F=0.814，P=0.500)。CRD容積為0.04、0.06、0.08 mL時，B組腹壁肌電幅值顯著高于A組、C組、D組(P<0.05)，而后三組之間擴張容積為0.04、0.06 mL的腹壁肌電幅值相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

四、小鼠腰骶段脊髓背角SP、CGRP表達

1.脊髓背角SP表達：SP陽性神經(jīng)元集中分布于脊髓背角淺層，呈細胞質(zhì)內(nèi)褐色顆?；蚣毥z狀，對稱分布。A組、C組和D組SP表達均顯著低于B組(P=0.000，P=0.010，P=0.035)，而這三組之間無明顯差異(P>0.05)(圖2、表3)。

2.脊髓背角CGRP表達：CGRP陽性神經(jīng)元表達于脊髓背角，呈細胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒。四組小鼠CGRP表達無明顯差異(F=1.530，P=0.225)(圖3、表3)。

五、脊髓背角SP、CGRP表達水平與腹壁肌電幅值的相關(guān)性分析

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)結(jié)果(HE染色，×200)

表2 不同擴張容積時各組小鼠腹壁肌電幅值比較

與B組比較，*P<0.05，**P<0.01；#與A組比較，P<0.05

圖3 各組小鼠脊髓背角CGRP表達情況(免疫組化染色，×400)

表3 各組脊髓背角SP、CGRP表達

*與B組比較，P<0.05

CRD擴張容積為0.04、0.06、0.08 mL時，脊髓背角SP表達與腹壁肌電幅值之間呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.467，P=0.016；r=0.517，P=0.007；r=0.588，P=0.002)；擴張容積為0.02 mL時，兩者之間無明顯相關(guān)性(r=0.200，P=0.327)。

CRD擴張容積為0.02、0.04、0.06、0.08 mL時，脊髓背角CGRP表達與腹壁肌電幅值之間無相關(guān)性(P>0.05)。

討 論

本研究結(jié)果提示，糞便濾液灌腸治療可改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)改變、降低腹壁肌電幅值、下調(diào)脊髓痛覺相關(guān)分子SP表達，說明FMT可改善結(jié)腸炎小鼠的內(nèi)臟敏感性。

FMT因用于治療艱難梭菌相關(guān)性腸炎療效顯著且能改善IBD病情而成為近年研究熱點。FMT可使UC患者恢復(fù)腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能、減輕腸道炎癥，甚至可逐漸達到完全性黏膜愈合[13]。現(xiàn)有觀點認為疾病的改善與接受FMT后患者腸道細菌組成的長時間改變和糞便混懸液中供者細菌產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。但也有研究[14]發(fā)現(xiàn)經(jīng)FMT治療后UC患者腸道菌群的轉(zhuǎn)變與臨床癥狀之間無相關(guān)性，提示FMT的作用可能不僅僅是通過改變腸道菌群組成而實現(xiàn)的。

本研究中，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠在經(jīng)糞便濾液灌腸后，DAI和結(jié)腸組織病理學(xué)評分均較模型對照組改善，提示炎癥緩解。CRD實驗中，0.02 mL擴張容積下各組間腹壁肌電水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮此壓力可能尚未達到小鼠疼痛閾值；而在0.04、0.06、0.08 mL 擴張容積下，糞便濾液組腹壁肌電幅值明顯低于模型對照組，而與正常對照組無明顯差異，說明FMT可降低結(jié)腸炎小鼠內(nèi)臟敏感性。因此，當(dāng)有適應(yīng)證的患者進行FMT治療時，不僅可控制腸道炎癥，而且還可通過降低內(nèi)臟高敏感來減輕疾病活動期或緩解期可能出現(xiàn)的腹痛、腹瀉等癥狀。但本研究的動物模型是急性腸炎模型，急性炎癥時因FMT治療而得到控制的內(nèi)臟高敏感是否能長期維持尚不明確，仍需行FMT長程療效的觀察研究以明確其是否能對內(nèi)臟敏感性產(chǎn)生遠期影響。

SP是脊髓水平傳遞傷害性信息的重要神經(jīng)遞質(zhì)，其升高與炎癥引起的腹痛程度密切相關(guān)，SP在腸道炎癥引起的脊髓背角神經(jīng)元敏感化中起重要作用[15]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)糞便濾液干預(yù)治療后，小鼠結(jié)腸炎癥減輕，SP表達顯著低于模型對照組，且與擴張容積為0.04、0.06、0.08 mL時的腹壁肌電幅值之間存在正相關(guān)關(guān)系。說明內(nèi)臟敏感性增高與SP表達水平有關(guān)，F(xiàn)MT可降低結(jié)腸炎性刺激引起的脊髓背角神經(jīng)元敏感化，并通過抑制SP釋放來阻斷痛覺信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。CGRP是外周感覺傳入神經(jīng)元中與SP共存的一種神經(jīng)肽，不僅可直接產(chǎn)生傷害性作用，還參與炎癥誘導(dǎo)的內(nèi)臟傷害性感覺[16]。本實驗中，經(jīng)灌腸干預(yù)后的各組CGRP表達無明顯差異，提示FMT可能并非主要通過影響脊髓中CGRP表達來發(fā)揮作用；此外，本研究中DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型的炎癥程度較輕，從而未能引起脊髓背角CGRP表達明顯增加，是否更嚴重的炎癥情況下FMT可降低CGRP表達仍有待進一步研究。

雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊是由雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌組成的活菌制劑，可補充腸道有益菌，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡以及黏膜免疫功能，抑制有害微生物的生長繁殖。一項meta分析表明，益生菌治療有益于UC患者的誘導(dǎo)緩解，其維持緩解的效果與5-氨基水楊酸相當(dāng)[17]。本實驗中糞便濾液組和雙歧桿菌三聯(lián)活菌組之間DAI評分、結(jié)腸組織病理學(xué)評分、腹壁肌電幅值以及腰骶髓SP、CGRP表達均無明顯差異，且兩組與正常對照組之間亦無明顯差異。理論上而言，F(xiàn)MT為原生態(tài)腸道菌群重建，效果應(yīng)優(yōu)于雙歧桿菌三聯(lián)活菌單獨治療的效果，導(dǎo)致兩者療效無差異可能的原因包括：①本實驗中糞便濾液制作技術(shù)條件有限，糞便收集過程不能達到理想的無菌、無氧等狀態(tài)；② 2.0% DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型炎癥程度較輕，加之實驗周期長，小鼠結(jié)腸炎有一定的自愈傾向。

綜上所述，本研究中FMT可減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥，降低腹壁肌電幅值和腰骶髓SP表達。提示FMT具有降低內(nèi)臟敏感性的作用，這種作用可能與抑制脊髓背角SP表達有關(guān)，這為FMT在IBD的治療中提供了實驗基礎(chǔ)。