張海波， 黃 瓊， 盧 帥， 李志強(qiáng)， 陳 蓓， 趙 軍

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊 830054； 2藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011；3新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)有限公司， 烏魯木齊 830013; 4新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心， 烏魯木齊 830011)

阿苯達(dá)唑(albendazole，ABZ)因其治療包蟲(chóng)感染療效良好、毒性作用小及其藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)方面的優(yōu)勢(shì)，已成為包蟲(chóng)病藥物治療的首選，成為 WHO 推薦的抗包蟲(chóng)病的一線藥物，也是目前公認(rèn)的抗細(xì)粒棘球蚴有效藥物[1]。ABZ 給藥吸收后在肝臟/腸內(nèi)迅速代謝為阿苯達(dá)唑亞砜(albendazole sulphoxide，ABZSO)，ABZSO 進(jìn)而轉(zhuǎn)化成阿苯達(dá)唑砜(albendazole sulphone，ABZSO2)，最終代謝為阿苯達(dá)唑-氨基砜(albendazole amino sulphone，ABZSO2-NH2)，其中，ABZSO是主要的代謝產(chǎn)物和抗包蟲(chóng)的活性成分[2]。阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體混懸液是由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院溫浩等研制的阿苯達(dá)唑新劑型，現(xiàn)已成功轉(zhuǎn)化為醫(yī)院制劑，用于臨床包蟲(chóng)病的治療。課題組前期研究表明，大鼠或小鼠給藥阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體混懸液后血中 ABZSO和ABZSO2濃度及其生物利用度均有所提高，藥物在體內(nèi)的存留時(shí)間延長(zhǎng)，體內(nèi)分布速度加快，并具有一定的肝靶向性[3-5]。生物樣品中 ABZ 及其代謝物的檢測(cè)多以ABZSO和ABZSO2為指標(biāo)成分，檢測(cè)方法以 HPLC-UV[6]最為常用。因液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有準(zhǔn)確度高、可靠性強(qiáng)、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、分析快速且成本低等優(yōu)點(diǎn)，在生物樣本分析中得到了廣泛的應(yīng)用[7]。本研究建立了同時(shí)測(cè)定綿羊血漿中ABZ、ABZSO、ABZSO2及ABZSO2-NH2濃度的超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-Q-TOF-MS)分析方法，并應(yīng)用該方法測(cè)定綿羊灌胃給予阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體混懸液后經(jīng)時(shí)血藥濃度，計(jì)算其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為進(jìn)一步研究阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體混懸液在體內(nèi)的吸收和代謝提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器BP211D型分析天平(德國(guó)Sartorius公司)，Acquity UPLC I-Class型超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，Xevo G2-S QTof型質(zhì)譜檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)，MassLynx V4.1版本工作站(美國(guó)Waters公司)，F(xiàn)JY1002-4VF基因研究型超純水機(jī)(青島富勒姆科技有限公司)，LG10-2.4A型高速冷凍離心機(jī)(中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，MS 3 basic型渦旋振蕩器(德國(guó)IKA公司)，DZKW型4孔電子恒溫水浴鍋(北京永興明醫(yī)療儀器廠)，KQ-200VDB型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥阿苯達(dá)唑(ABZ，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：081M1540V，純度>98%)，阿苯達(dá)唑亞砜(ABZSO，加拿大TRC公司，批號(hào)：5-ABY-166-1，純度>98%)，阿苯達(dá)唑砜(ABZSO2，加拿大TRC公司，批號(hào)：SZBB229XV，純度>98%),阿苯達(dá)唑氨基砜(ABZSO2-NH2，美國(guó)SCBT公司，批號(hào)：sc-207278，純度≥98%)，內(nèi)標(biāo)物甲苯咪唑(mebendazole，MBZ，加拿大TRC公司，批號(hào)：4-XYZ-40-1，純度>98%)，甲醇(美國(guó)Fisher公司，批號(hào)：143714)，乙腈(美國(guó)Fisher公司，批號(hào)：155753)，甲酸(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20140629)，去離子水(FJY1002-4VF基因研究型超純水機(jī)制水)，阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體混懸液(ABZ 含量10.0 mg/mL，批號(hào)：20130822，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6只健康綿羊，雌性，體質(zhì)量(23.0±2.2)kg，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK (新) 2011-0004。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC○RBEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-水(0.1% 甲酸，B)，梯度洗脫條件[ 0～3.5 min (10%～55% B)，3.5～3.8 min (55%～90% B)，3.8～4.4 min (90% B)，4.4～6 min (90%～10% B)]，流速：0.4 mL/min，柱溫：40℃，進(jìn)樣器溫度：10℃，進(jìn)樣量：2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 正離子模式，離子源參數(shù)：毛細(xì)管電壓 0.5 kV，離子源溫度100℃，脫溶劑溫度 450℃，錐孔電壓 40 V，提取錐孔電壓80 V，錐孔氣流量50 L/h，脫溶劑氣流量(N2)800 L/h。選擇監(jiān)測(cè)離子檢測(cè)( SIM)：ABZ m/z 266.096，ABZSO m/z 282.091，ABZSO2m/z 298.086，ABZSO2-NH2m/z 240.081，內(nèi)標(biāo)MBZ m/z 296.104 (均為質(zhì)子化的母離子[M+H]+)，見(jiàn)圖1-5。

圖1 ABZ 化學(xué)結(jié)構(gòu)及母離子[M+H]+質(zhì)譜圖

2.2溶液的配制方法

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 稱取ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2和MBZ標(biāo)準(zhǔn)品適量，甲醇溶解，配制成濃度為100 μg/mL的儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋得8個(gè)濃度混合對(duì)照品溶液和固定濃度內(nèi)標(biāo)溶液，用于制備各濃度的校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖2 ABZSO 化學(xué)結(jié)構(gòu)及母離子[M+H]+質(zhì)譜圖

圖3 ABZSO2 化學(xué)結(jié)構(gòu)及母離子[M+H]+質(zhì)譜圖

圖4 ABZSO2-NH2 化學(xué)結(jié)構(gòu)及母離子[M+H]+質(zhì)譜圖

圖5 MBZ 化學(xué)結(jié)構(gòu)及母離子[M+H]+質(zhì)譜圖

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品和質(zhì)控血漿樣品的的配制 分別取“2.2.1”項(xiàng)下8個(gè)濃度混合對(duì)照品溶液20 μL，氮?dú)獯蹈?，加入空白綿羊血漿200 μL復(fù)溶，渦旋混勻，制得8個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2在血漿中的有效質(zhì)量濃度范圍分別為6.2～798.0、5.2～5 370.0、3.3～3 168.0、8.6～1 100.0 ng/mL。同法制備3個(gè)濃度水平質(zhì)控(quality control, QC)樣品，低濃度質(zhì)控(low QC, LQC)樣品ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2濃度分別為18.6、15.6、9.9、25.8 ng/mL，中濃度質(zhì)控(middle QC, MQC)樣品分別為319.2、2 148.0、1 267.2、440.0 ng/mL， 高濃度質(zhì)控(high QC, HQC)樣品濃度分別為638.4、4 296.0、2 534.4、880.0 ng/mL。

2.3動(dòng)物的給藥和血樣采集方法6只健康綿羊，單劑量灌胃給予阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體混懸液，給藥劑量為10 mg/kg。給藥前禁食不禁水 12 h，于給藥前和給藥后 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0、36.0、48.0、60.0 和 72.0 h 頸靜脈采血，每次取血 5 mL于肝素管中，3 000 r/min 離心 10 min，分離上層血漿，-80℃儲(chǔ)存待測(cè)。

2.4血漿樣品的處理取20 μL內(nèi)標(biāo)溶液(357.7 ng/mL)，氮?dú)獯蹈桑尤胙獫{樣品200 μL，渦旋混勻2 min，超聲處理10 min，加入乙腈800 μL，渦旋混勻2 min，4℃ 12 000 r/min 離心20 min，取上清液2 μL按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件分析。

2.5專屬性按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件分析，ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2和內(nèi)標(biāo)MBZ保留時(shí)間分別為3.81、2.42、2.64、1.27和3.71 min左右，無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，具有良好的專屬性。綿羊空白血漿添加ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2和內(nèi)標(biāo)MBZ的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，口服阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體混懸液后血漿樣品的典型色譜圖，見(jiàn)圖6-7。

圖6 空白綿羊血漿添加對(duì)照品典型色譜圖

2.6回歸方程的建立取“2.2.2”項(xiàng)下 8 個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，以ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2的標(biāo)準(zhǔn)濃度(C)為橫坐標(biāo)，ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法進(jìn)行線性擬合，得線性回歸方程及定量范圍，見(jiàn)表1。

圖7 綿羊口服阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體混懸液后血漿樣品典型色譜圖

名稱回歸方程r定量范圍/(ng/mL)ABZY=0.031 8 C+0.588 60.999 56.2～798.0ABZSOY=0.010 9 C+0.834 00.998 15.2～5 370.0ABZSO2Y=0.017 4 C+0.042 00.999 43.3～3 168.0ABZSO2-NH2Y=0.002 8 C+0.220 70.998 88.6～1 100.0

2.7精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)取 3 個(gè)濃度水平的QC樣品，每個(gè)濃度平行測(cè)定5份，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，連續(xù)測(cè)定3 d。采用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品測(cè)定濃度，根據(jù)測(cè)定值與實(shí)際值進(jìn)行計(jì)算，考察方法的精密度與準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，本法ABZ及其3種代謝產(chǎn)物3個(gè)質(zhì)控濃度血漿樣品分析的日內(nèi)、日間精密度RSD均<15%，準(zhǔn)確度偏差均<15%，表明該方法精密度和準(zhǔn)確性較好。

2.8回收率和基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)取3個(gè)濃度水平的QC樣品，每個(gè)濃度平行測(cè)定5份，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定阿苯達(dá)唑及其3種代謝產(chǎn)物峰面積為A；另取空白血漿樣品，加入乙腈(體積比1∶4)，渦旋混勻2 min，4℃ 12 000 r/min，離心20 min，取上清液得空白血漿提取液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法處理，制成3 個(gè)濃度水平的對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行測(cè)定5份，測(cè)定其峰面積為B；用水-乙腈(體積比1∶4)制成 3 個(gè)濃度水平的對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行測(cè)定5份，測(cè)定其峰面積為C，按A/B×100% 計(jì)算提取回收率，按B/C×100% 計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果顯示ABZ及其3種代謝產(chǎn)物3個(gè)質(zhì)控濃度提取回收率范圍為95.3%～107.4%，RSD<14.4%；基質(zhì)效應(yīng)范圍為95.7%～108.7%，RSD<12.0%；MBZ 提取回收率為103.2%，RSD=7.3%；基質(zhì)效應(yīng)為98.5%，RSD=12.3%，表明該方法提取回收率較高,精密度良好,且無(wú)基質(zhì)效應(yīng)。

2.9稀釋可靠性考察取80 μL制備定量上限(ULOQ)標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的對(duì)照品溶液，氮?dú)獯蹈桑尤肟瞻籽獫{200 μL復(fù)溶，渦旋混勻，制得濃度4倍于ULOQ的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，平行制備5份樣品，取100 μL，每份添加400 μL空白綿羊血漿稀釋5倍，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，采用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算稀釋樣品測(cè)定濃度，根據(jù)測(cè)定值與實(shí)際值進(jìn)行計(jì)算，考察精密度與準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示準(zhǔn)確度和精密度在±8%之內(nèi)，表明樣品稀釋不影響準(zhǔn)確度和精密度，因此濃度高于ULOQ的血漿樣品可以用空白血漿充分稀釋后重新分析。

2.10殘留效應(yīng)考察進(jìn)樣分析ULOQ標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品后，進(jìn)樣分析空白血漿樣品，根據(jù)峰面積比值進(jìn)行計(jì)算，考察殘留效應(yīng)。ABZ及其3種代謝產(chǎn)物殘留均小于10%，內(nèi)標(biāo)的殘留小于1%，表明該實(shí)驗(yàn)的殘留效應(yīng)是可以忽略不計(jì)的。

2.11穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.11.1 儲(chǔ)備液穩(wěn)定性 將“2.2.1”項(xiàng)下儲(chǔ)備液在室溫(25℃)放置3 h及冷藏條件下(2～8℃)放置15 d的穩(wěn)定性，通過(guò)稀釋儲(chǔ)備液，進(jìn)樣，計(jì)算ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值，并同新鮮配制的儲(chǔ)備液同法得到的比值相比較，范圍為87.7 %～105.4%，RSD<9.6%，表明儲(chǔ)備液在上述條件下穩(wěn)定。

2.11.2 質(zhì)控樣品凍融穩(wěn)定性 配制3個(gè)濃度水平的QC樣品，-80℃冷凍冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?，?個(gè)濃度水平QC樣品，每個(gè)濃度平行測(cè)定5份，室溫融化，當(dāng)完全解凍時(shí)，樣品在-80℃條件下再冷凍24 h，重復(fù)兩次凍融循環(huán)，在第3個(gè)循環(huán)按“2.4”項(xiàng)下方法操作，采用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品測(cè)定濃度，根據(jù)測(cè)定值與實(shí)際值進(jìn)行計(jì)算，考察兩者間的偏差，結(jié)果顯示偏差在10%以內(nèi)，RSD<12.31%，表明樣品的凍融穩(wěn)定性良好。

2.11.3 質(zhì)控樣品短期穩(wěn)定性 取3個(gè)濃度水平的QC樣品，每個(gè)濃度平行測(cè)定5份，于室溫放置4 h，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，采用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品測(cè)定濃度，根據(jù)測(cè)定值與實(shí)際值進(jìn)行計(jì)算，考察兩者間的偏差，結(jié)果顯示偏差在15%以內(nèi)，RSD<14.26%，表明血漿樣品在處理過(guò)程中，室溫放置4 h穩(wěn)定性良好。

2.11.4 質(zhì)控樣品長(zhǎng)期穩(wěn)定性 取3個(gè)濃度水平的QC樣品，每個(gè)濃度平行測(cè)定5份，于-80℃冷凍冰箱儲(chǔ)存2個(gè)月，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，采用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品測(cè)定濃度，根據(jù)測(cè)定值與實(shí)際值進(jìn)行計(jì)算，考察兩者間的偏差，結(jié)果顯示偏差在15%以內(nèi)，RSD<12.14%，表明血漿樣品在-80℃冷凍冰箱儲(chǔ)存1個(gè)月穩(wěn)定性良好。

2.11.5 處理后樣品穩(wěn)定性 取3個(gè)濃度水平的QC樣品，每個(gè)濃度平行測(cè)定5份，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，置自動(dòng)進(jìn)樣器(10℃，24 h)進(jìn)樣測(cè)定，采用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品測(cè)定濃度，根據(jù)測(cè)定值與實(shí)際值進(jìn)行計(jì)算，考察兩者間的偏差，結(jié)果顯示偏差在15%以內(nèi)，RSD<12.37%，表明血漿樣品處理后在自動(dòng)進(jìn)樣器(10℃)24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.12藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定取“2.3”項(xiàng)下所采集的血漿樣品，按“2.4”項(xiàng)下處理方法進(jìn)行前處理，經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)的血漿藥物濃度，并繪制藥時(shí)曲線，見(jiàn)圖8，將血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用Kinetica 5.1程序進(jìn)行非房室模型分析，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，見(jiàn)表2。

表2 ABZSO和ABZSO2在綿羊體內(nèi)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

注：Cmax：達(dá)峰濃度；Tmax：達(dá)峰時(shí)間；AUC：血藥濃度-時(shí)間曲線下面積；T1/2：消除半衰期；MRT：平均滯留時(shí)間；CL：清除率；Vz：表觀分布容積。

圖8 綿羊灌胃給予阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體混懸液后ABZSO和ABZSO2的藥時(shí)曲線

3 討論

本研究建立了 UPLC-Q-TOF-MS法測(cè)定阿苯達(dá)唑及其 3 種代謝產(chǎn)物(阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑氨基砜)血藥濃度的方法，參考相關(guān)生物分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[7-8]對(duì)建立的方法進(jìn)行系統(tǒng)的驗(yàn)證，結(jié)果表明方法靈敏度較高，滿足血藥濃度測(cè)定要求。采用乙腈直接沉淀蛋白處理血漿樣品，具有前處理簡(jiǎn)單，成本較低等優(yōu)點(diǎn)。綿羊口服阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體混懸液后在血漿中均不能檢測(cè)到ABZ，這可能與肝臟的首過(guò)效應(yīng)有關(guān)；給藥后36、48 h后能檢測(cè)到較低濃度ABZSO2-NH2，結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[9-11]，故本研究未對(duì)ABZ及ABZSO2-NH2進(jìn)行完整的藥代動(dòng)力學(xué)分析。血漿中ABZSO濃度高于ABZSO2，ABZSO是ABZ在綿羊體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物和抗包蟲(chóng)的活性成分。本研究為阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體混懸液的臨床應(yīng)用提供有價(jià)值的參考，也將為該制劑的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。