張 華，岳曉禹

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院， 河南 鄭州 450046 )

儲(chǔ)糧玉米從收獲入庫(kù)到儲(chǔ)藏的各個(gè)階段都有可能被細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物所污染，這些微生物在適宜生長(zhǎng)的條件下會(huì)迅速生長(zhǎng)繁殖，對(duì)儲(chǔ)糧的品質(zhì)與質(zhì)量安全有著重要影響[1]。其中對(duì)儲(chǔ)糧玉米危害最為嚴(yán)重的是霉菌及其代謝產(chǎn)物[2,3],它們不僅可以導(dǎo)致儲(chǔ)糧玉米發(fā)生霉變，而且還可產(chǎn)生霉菌毒素。在玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中雖外表看不出有霉變，但已受霉菌毒素污染，食用也可引起人畜中毒[4]。產(chǎn)毒菌主要來(lái)源于曲霉菌屬[5]、青霉菌屬[6，7]、鐮刀霉菌屬[8]等。有關(guān)儲(chǔ)糧玉米表面微生物真菌多樣性的研究，多采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)的方法，如平板培養(yǎng)分離鑒定[9，10]，稀釋涂布平板和biolog系統(tǒng)相結(jié)合[11]等，這些方法雖然能直觀的反應(yīng)真菌種屬，但也存在較大的誤差。在研究?jī)?chǔ)糧表面微生物時(shí)，分子生物學(xué)技術(shù)如DGGE具有一定的優(yōu)勢(shì)，先提取儲(chǔ)糧表面微生物的全基因組DNA，PCR技術(shù)擴(kuò)增特定目的DNA片段，通過(guò)變性梯度凝膠電泳技術(shù)將堿基組成不同的DNA分離。本試驗(yàn)采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)河南、黑龍江地區(qū)糧庫(kù)的儲(chǔ)糧玉米進(jìn)行霉菌菌群分析，為掌握儲(chǔ)糧過(guò)程中霉菌變化規(guī)律提供參考。

1 材料與方法

1.1 玉米樣品的來(lái)源與存放

儲(chǔ)藏玉米采集于黑龍江儲(chǔ)藏糧庫(kù)，時(shí)間為2013、2014、2015年，玉米品種為龍?jiān)?88、龍育4號(hào)。河南儲(chǔ)藏糧庫(kù)中采集儲(chǔ)藏玉米的時(shí)間為2013、2014、2015年，玉米品種為鄭單958、浚單20、先玉335、偉科702。將上述玉米樣品包裹完整后放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

超聲波振蕩器(KQ-250B,中國(guó)上海早盈公司)；低溫高速離心機(jī)(H1850R,湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增儀(2720型,美國(guó)Biometra公司)；變性梯度凝膠電泳儀(DCodeTMUniversalMutationDetectionSystemDGGE及凝膠成像分析系統(tǒng)Gel Doc XR，美國(guó)Bio-Rad公司)。N,N-亞甲基二丙烯酰胺(Bis)和丙烯酰胺(Acr)均購(gòu)自美國(guó)Amresco公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取儲(chǔ)糧玉米表面真菌全基因組DNA(改良CTAB法)

各稱(chēng)取25g河南、黑龍江糧庫(kù)不同年份的玉米，置于經(jīng)高壓滅菌過(guò)的錐形瓶中，加入40mLPBS磷酸鹽緩沖液(滅菌)，放入超聲波振蕩器中振蕩1 h。將其中的20 mL裝入滅菌后的50mL離心管中，3000 r/min、4 ℃、離心5 min。收集上清液于50mL離心管中，8000 r/min、4℃，離心10min，沉淀得到菌體。采用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取儲(chǔ)糧玉米表面真菌[12,13]，加入2mL 2% CTAB溶液，65℃預(yù)熱30min，充分混勻，于65℃水浴1h，期間每10min混勻一次，取出冷卻至室溫。參照酚-氯仿-異戊醇的操作方法提取儲(chǔ)糧玉米表面真菌全基因組DNA[14]。

1.3.2 目的片段真菌18S rRNA部分的PCR擴(kuò)增

以提取的真菌基因組DNA為模板，通過(guò)DNAman軟件篩選出Ns7F和Ns8R引物擴(kuò)增真菌18S rRNA部分序列，PCR產(chǎn)物片段的大小為353 bp。帶有GC夾的Ns7F引物：CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CAT AAC AGG TCT GTG ATG C和Ns8R引物：GCA GGT TCA CCT ACG GA。PCR反應(yīng)體系： 25μL 2×Pfu Master Mix；1μL帶有GC夾的Ns7F及1μLNs8R；1μL儲(chǔ)糧玉米表面真菌全基因組DNA，0.2μL的Mg2+，ddH2O 21.8μL。擴(kuò)增程序：94℃加熱預(yù)變性5 min，94 ℃加熱變性1 min，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4 ℃保存。1.2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。

1.3.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)和測(cè)序

采用Bio-Rad公司DCodeTM 型DGGE儀器，制備變性劑濃度從30%～ 60%的聚丙烯酰胺凝膠。電泳條件如下：60 ℃恒溫、電泳緩沖液為1×TAE，先用120V電壓將樣本帶出點(diǎn)樣孔后，85V恒壓電泳12 h。 待電泳結(jié)束后將凝膠取出放在溴化乙錠(EB)溶液中進(jìn)行染色0.5 h。用Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)將染色后的凝膠進(jìn)行拍照保存。將DGGE 圖譜上的主要條帶切膠回收，回收后的條帶再使用不帶GC夾的引物(Ns7F和Ns8R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物提交上海生工測(cè)序。測(cè)序得到的序列進(jìn)行BLAST程序同源性比較，以百分?jǐn)?shù)最高的比對(duì)結(jié)果作為該電泳條帶的物種解釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 變性梯度凝膠電泳結(jié)果與相關(guān)分析

所測(cè)序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，相似性≥97%的序列則視為同一序列。結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同地區(qū)糧庫(kù)儲(chǔ)藏玉米中霉菌群落的DGGE圖譜

13A為河南地區(qū)2013年入庫(kù)樣品，14B為河南地區(qū)2014年入庫(kù)樣品，15C為河南地區(qū)2015年入庫(kù)樣品，13D為黑龍江地區(qū)13年入庫(kù)樣品，14E為黑龍江地區(qū)14年入庫(kù)樣品，15F為黑龍江地區(qū)15年入庫(kù)樣品。變性梯度凝膠電泳(DGGE)圖譜中，條帶的明亮程度相對(duì)該物種存在的豐富度高低[15]，從DGGE圖譜可以看出：河南、黑龍江不同地區(qū)糧庫(kù)中，儲(chǔ)糧玉米樣品表面霉菌群落差異明顯。13D樣品中霉菌群落條帶較多，但亮度高的條帶較少，這表明儲(chǔ)糧玉米在貯藏過(guò)程中，由于糧庫(kù)貯藏環(huán)境良好，霉菌菌落并不是優(yōu)勢(shì)菌群，這與糧庫(kù)的溫度、濕度成相關(guān)性。而14B和15C，14E和15F圖譜中條帶比較相似，表明霉菌菌落的分布與貯藏年限關(guān)系不大。

2.2 變性梯度凝膠電泳主要條帶測(cè)序結(jié)果與分析

將如圖1中的條帶進(jìn)行回收，用不加GC鉗的Ns7F和Ns8R引物PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行Sanger測(cè)序，將測(cè)序所得堿基序列通過(guò)BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，結(jié)果如表1所示，可以看出無(wú)論是河南還是黑龍江糧庫(kù)樣品，亮度最高的條帶為DGGE圖譜中標(biāo)注為2，物種注釋是Zea mays clone 1686087 mRNA sequence，即來(lái)源于玉米自身的基因組序列，這可能是由于在提取玉米表面微生物過(guò)程中導(dǎo)致玉米細(xì)胞壁破損，釋放出較多的玉米基因組DNA。從得到的霉菌種類(lèi)上看，河南及黑龍江兩地糧庫(kù)中污染的霉菌有以下幾種：產(chǎn)紫青霉菌(Penicilliumpurpurogenum)、斜臥青霉菌(Penicilliumdecumbens)及一株未鑒定到種的青霉物種(Penicilliumsp)，此外還發(fā)現(xiàn)了假灰綠曲霉(Aspergilluspseudoglaucus)和曲霉屬真菌(Aspergillusneoflavipes)。同時(shí)還檢測(cè)到有部分非霉菌的真菌物種，如Candida sp和Meyerozyma guilliermondii。

表1 堿基序列比對(duì)

3 討論

變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)是研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一[16]，它能夠提供并分析樣品群落中的優(yōu)勢(shì)種類(lèi)信息并同時(shí)分析多個(gè)樣品，同時(shí)具備可重復(fù)性和操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，適合于研究微生物種群的多樣性及時(shí)空變化，在食品微生物真菌多樣性研究方面也逐漸采用這種方法[17,18]。與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)的方法相比，如平板培養(yǎng)，biolog系統(tǒng)等，DGGE技術(shù)可以鑒定出糧食表面微生物無(wú)法利用傳統(tǒng)方法分離出來(lái)的菌株，可快速分析大量樣本，客觀評(píng)價(jià)群落里特異的菌群。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)糧玉米主要的污染為青霉和曲霉，這與周玉庭等[18，19]報(bào)道中的結(jié)果相一致。結(jié)果表明，在儲(chǔ)糧玉米貯藏過(guò)程中，霉菌菌落并不是優(yōu)勢(shì)菌群，這還與糧庫(kù)的溫度、濕度相關(guān)。